2017 Fiscal Year Annual Research Report
光障害時におけるオートファジーを介した葉緑体品質管理とその制御機構の解析
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16J03408
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
中村 咲耶 東北大学, 生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | オートファジー / 光障害 / クロロファジー / 葉緑体 / シロイヌナズナ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、光障害時におけるクロロファジーの分解メカニズム、特に障害葉緑体の選択的除去を可能にする制御機構を明らかにすることを目的としている。これまでに、光障害により膨張した葉緑体が選択的に除去されることを明らかにしてきた。
オートファジーの主な経路として、オートファゴソームを形成することで基質を輸送するマクロオートファジーと、液胞膜が直接基質を取り込むミクロオートファジーの経路が知られている。そこで、クロロファジー経路において、光障害葉緑体がどのように液胞内へと取り込まれるかを明らかにするため、前年度から作製していたオートファゴソームマーカーATG8や液胞膜を蛍光タンパク質で可視化した系統を用いてライブセルイメージングを行った。まず、ATG8をGFPにより可視化した系統を、強光照射から1日後に観察すると、膨張した葉緑体の周辺に部分的にATG8が蓄積している様子が観察された。この系統の観察を複数回行ったものの、ATG8のシグナルが葉緑体全体を包み込む様子は観察されなかったため、液胞膜が直接基質を取り込むミクロオートファジーの系を介しているのではないかと考え、液胞膜を可視化した系統の観察を行った。すると、膨張した葉緑体を液胞膜が直接取り囲んでいる様子が観察された。また、オートファジー機能欠損変異株atg5ではこのような様子は見られなかった。つまり、ATG8が膨張した葉緑体を基質として標識し、これを液胞膜が直接取り囲んでいくミクロオートファジーの系を介していることが示された。
クロロファジー機能欠損変異体のスクリーニングについては、観察数を約10,000個体まで増やし、変異体単離を継続して行っている。得られた候補株は、随時、戻し交配を行っており、次世代シークエンサーによるゲノムリシーケンスに向けたサンプリングを行った。次年度はリシーケンスを実施し、原因遺伝子を絞り込む予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度に計画していた、液胞膜やオートファゴソーム膜などを蛍光タンパク質により可視化した各種系統の観察はおおむね完了している。光障害によって生じた膨張葉緑体の周辺にオートファゴソームマーカーであるATG8が部分的に蓄積する様子、および、液胞膜が直接葉緑体を包み込む様子が観察された。よって、ATG8が選択的な分解における基質の標識に関与していること、また、液胞膜が直接基質を取り込むミクロオートファジーの経路を取っていることを明らかにした。また、クロロファジー機能欠損変異体単離のためのスクリーニングは、目標としていた約10,000個体の観察を完了しており、得られた候補株の戻し交配を行っている。戻し交配が先行している系統から、随時、原因遺伝子の同定のためのリシーケンスのサンプリングを進めており、次年度から実際にリシーケンスを行う体制が整っている。以上より、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度に行ったライブセルイメージングにより、光障害によって誘導されるクロロファジーの輸送経路を明らかにすることができた。今後はさらに、タイムラプスイメージングにより、さらに詳細に、オートファゴソームマーカーであるATG8の動態や、液胞膜に包み込まれた後どのように葉緑体が液胞内へと放出されるか、などを明らかにしていく予定である。
また、クロロファジー欠損変異体単離のためのスクリーニングでは、得られた候補株の中に既知のオートファジー機能遺伝子の変異体が含まれている可能性が高いため、老化や栄養飢餓などで誘導される一般的なオートファジーは機能するが、クロロファジーのみが誘導されない変異体を、2次スクリーニングとして選抜している。この2次スクリーニングを継続して行い、得られた候補株を親株と戻し交配したのち、次世代シーケンサーによる全ゲノムリシーケンスを行い、原因遺伝子を絞り込んでいく予定である。
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