2016 Fiscal Year Annual Research Report
上皮細胞システムの力覚応答を司るＲｈｏシグナルと細胞骨格制御の統合的理解
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16J04133
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
藤原 佐知子 大阪大学, 基礎工学研究科, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | メカニカルストレス / Rho-GEF / 上皮細胞 / 力覚応答 / 細胞骨格 / 細胞-基質間接着 / 細胞間接着 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、上皮細胞集団の秩序化における力覚応答（力学的シグナルによる細胞機能の変化）役割やその分子機構の解明を目的とする。本年は力覚応答に必要なRhoのGDP-GTP交換因子として同定したSoloの上皮細胞における機能に着目し研究を行い、下記の成果を得た。
1.細胞-基質間接着部位でのケラチンネットワークの構築に対するSoloの関与
上皮細胞は細胞-基質間接着部位にヘミデスモソームという複合体を形成しケラチン繊維を繋留させる。ヘミデスモソームは張力依存的に再構築されると報告されており、Soloがこのプロセスに関与する可能性を検証した。上皮細胞の細胞-基質間接着部位を全反射照明顕微鏡を用いて解析したところ、Soloの発現抑制細胞では細胞-基質間接着面のケラチンネットワークが粗になっていた。Soloがヘミデスモソームにおける張力の感知や細胞-基質間接着部位でのケラチンネットワークの構築に関与する可能性を見出した。
2.細胞間接着複合体タンパク質の局在に対するSoloの関与
上皮細胞の細胞間接着では、接着結合でアクチン繊維、デスモソームでケラチン繊維が繋留される。私は前年までに、Soloの発現抑制が細胞間接着部位におけるケラチン繊維の繋ぎとめを減弱させることを見出していた。その分子メカニズムを解明するため、細胞間接着複合体の代表的な構成蛋白質であるβカテニン（接着結合に局在）とプラコグロビン（接着結合とデスモソームの両方に局在）の局在を解析した。上皮細胞をシート状に培養し細胞間接着部位を詳細に観察すると、Soloの発現抑制によりβカテニンの局在には大きな変化はなかったがプラコグロビンの細胞間への局在が抑制された。Soloがプラコグロビンの細胞間への局在を制御し、細胞間での正常なケラチンネットワークの構築に寄与する可能性を見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、上皮細胞集団の秩序化における力覚応答（力学的シグナルによる細胞機能の変化）の役割やその分子機構の解明を目的とする。平成28年度は特に、力覚応答に必要なRhoのGDP-GTP交換因子として同定したSoloの上皮細胞における機能に着目し研究を実施し、Soloが細胞-基質間接着や細胞間接着の構築や、それら接着部位へのケラチン中間径フィラメントの繋ぎ止めに関与することを明らかにした。細胞が力学的環境に応答して細胞-基質間接着や細胞間接着を再構築する際、Soloがそのプロセスで機能している可能性を示すと共に、その分子メカニズムの一端も明らかにすることに成功した。これらの成果は本年度国内および国外の計9回の学会や研究会で発表した。以上から、おおむね順調に研究が進展していると判断される。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究は、細胞の力覚応答の分子機構の解明から、上皮細胞集団や上皮組織の秩序形成過程における力覚応答の役割の解明へとつなげることを目的としている。平成28年度は特に、アクチン骨格と中間径フィラメントの再構築を統御するRhoシグナルを中心とした力覚応答の分子機構について、Rhoファミリー活性化因子であるSoloを中心に解析した。その結果、力学的環境に応じた細胞-基質間接着構造や細胞間接着構造の制御にSoloが関与する可能性を新しく見出した。
今後は上皮細胞集団や上皮組織の秩序のある運動における力覚応答の機能を解明するために、上皮細胞の集団移動、創傷治癒、3次元培養下の上皮細胞の管腔構造形成のモデル実験系の確立を進める。細胞形態や細胞骨格系蛋白質の変化をリアルタイムで可視化解析し、Solo及びSolo結合蛋白質の発現抑制や変異体の過剰発現が及ぼす影響を解析する。
ここで力学的シグナルによる細胞や細胞集団の応答を解析するためには、細胞間接着部位や細胞－基質間接着部位にかかる力をリアルタイムで可視化解析する手法が不可欠である。そこで、細胞－基質間に発生する収縮力の計測として蛍光ビーズ法およびシリコーン膜法の技術習得および最適化を行う。また、Fluorescence resonance energy transfer (FRET) プローブを用いた方法の検討も行い、3次元環境下の細胞集団の力負荷分布をリアルタイムで可視化する方法を確立し、上記のモデル実験系での解析に用いる。
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