2017 Fiscal Year Annual Research Report
アデノウイルスベクターによる新生児を対象とした遺伝子治療の検討
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16J04751
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
飯塚 俊輔 大阪大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | アデノウイルスベクター / 遺伝子治療 / 新生児 / 肝臓 / 血友病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、遺伝子導入用ベクターとして優れた特長を有するアデノウイルス（Ad）ベクターを用いて、新生児に適した新規遺伝子治療薬を開発することを目的としている。これまでにAdベクターは新生マウスにおいても高い遺伝子導入効率を示すものの、Adベクター投与後にわずかにAd タンパク質が発現することで組織障害が誘導されることを明らかとしている。そこで、当研究室で独自に開発した肝臓特異的なmicroRNA であるmiR-122a を利用して、Ad 遺伝子の発現を抑制可能な改良型Adベクター（Ad-E4-122aT）を用いて検討を行うこととした。
本年度は、Ad-E4-122aTにさらなる改良を加えることで、より高効率な遺伝子導入が可能であるか検討するとともに、血友病Ａに対する遺伝子治療薬の開発を試みた。
当研究室ではこれまでに、AdベクターのファイバーノブC末端にリシン残基を7個付与することで、成体マウスにおける肝臓への遺伝子導入効率の向上に成功している。そこで、同様の改変をAd-E4-122aTに施こした。しかしながら、新生児マウス肝臓への遺伝子導入効率の向上は見られず、これ以上の検討は断念することとした。
次に、血友病Aに対する遺伝子治療を試みた。血友病A患者が欠損している血液凝固第8因子（FVIII）は血中半減期が約12時間と短いことが知られている。そこで免疫グロブリンGのFc領域との融合によりFVIIIの血中半減期を向上させることで、遺伝子治療効果が向上すると期待して、Fc融合FVIIIを構築した。さらに、Fc融合FVIIIを搭載したAd-E4-122aTを構築し、血友病A成体マウスに投与することで、融合タンパク質が血液凝固活性を示すか検討した。その結果、マウスの止血能を正常レベルにまで回復させることに成功し、Fc領域との融合によりFVIIIの活性が損なわれないことを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの知見をもとに、Adベクターの改良や新たな先天性遺伝子疾患である血友病Ａに対する遺伝子治療を試みた。期待通りの結果が得られず、難航する場面がみられたものの、粘り強く課題を解決しながら、改良型Adベクターの作製や、改良型FVIII遺伝子の作製を成し遂げた。また、基礎検討ではあるものの、改良型FVIII搭載Ad-E4-122aTを用いて成体マウスに対する遺伝子治療効果を検討することができ、本年度の目標を達成できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はFc融合FVIII搭載Ad-E4-122aTの遺伝子治療効果を、血友病Ａ新生仔マウスを用いて検討する。まず、Fc融合FVIIIの物性について、Fc融合FVIII搭載Ad-E4-122aT、FVIII搭載Ad-E4-122aTを投与した血友病Ａ成体マウスの血漿を用いて検討する。両血漿中のFVIII抗原量を揃えたのちに、血液凝固活性をaPTTアッセイにより評価することで、Fc領域との融合がFVIIIの比活性に与える影響を検討する。また、両血漿を血友病Ａ成体マウスに静脈内投与後、血中のFVIII抗原量・活性値を経時的に測定することで、血中半減期が向上するか検討する。次に、Fc融合FVIII搭載Ad-E4-122aTを生後二日の血友病Ａマウスに静脈内投与後、血中のFVIII抗原量・活性値を経時的に測定する。さらに、マウスの尾を切断し、止血するまでに要する時間を測定するtail clip assayを行うことで、マウスのphenotype評価を行い、Fc融合FVIII搭載Ad-E4-122aTの新生児遺伝子治療薬としての有効性を検討する。
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