2017 Fiscal Year Annual Research Report
泌乳による繁殖中枢抑制を担うリガンド・受容体の探索とＫｉｓｓ１エピジェネティクス
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16J05404
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
杉本 有沙 名古屋大学, 生命農学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | 泌乳 / キスペプチン / 黄体形成ホルモン / ソマトスタチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は泌乳中の繁殖能力低下による受胎率低下等の課題解決に資する基礎的知見の獲得に向け、泌乳中の繁殖機能抑制を担う中枢メカニズムの解明を目的とする。哺乳類の繁殖中枢であるキスペプチンニューロンに着目し、泌乳期キスペプチン遺伝子Kiss1の発現抑制メカニズム解明に向け、昨年度は次の実験を遂行した。
①ソマトスタチンが泌乳期繁殖機能抑制に関与する可能性についての検討
脳内でソマトスタチンが乳仔からの吸乳刺激を仲介し、視床下部弓状核においてKiss1発現を抑制するという仮説を立て、実験を行った。泌乳期後半のラット脳室内にソマトスタチン受容体２阻害剤を投与することで、Kiss1発現細胞数が増加すること、またキスペプチンが促進的に制御する、生殖機能の指標である血中黄体形成ホルモン濃度が上昇することを明らかにした。このことから、泌乳後半においてソマトスタチンがKiss1発現抑制、ひいては生殖機能の抑制に関与する可能性が示唆された。
②泌乳期Kiss1発現抑制のエピジェネティック制御機序の解明に向けたキスペプチンニューロン可視化ラットの作出と検討
泌乳期にキスペプチンニューロンでKiss1発現を制御する因子の探索を行うため、キスペプチンニューロン可視化ラットの作出を目指し実験を行った。所属研究室においてキスペプチンニューロン特異的タモキシフェン（TAM）誘導性Creリコンビナーゼ発現ラット（Kiss1-CreERT2ラット）を作出した。Creリコンビナーゼ依存的に黄色蛍光タンパクVenusを発現するラットと交配させて得られた産仔に、TAM活性代謝物を脳室内投与することにより、Venus蛍光によりキスペプチンニューロンが可視化されるか検討した結果、Venus蛍光は確認できなかった。現在TAM誘導性ではない、キスペプチンニューロン特異的Creリコンビナーゼ発現ラットを作成中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、次に示す二つの目的に向けた実験の進捗具合から、おおむね順調に進展していると考えられる。
①吸乳刺激をキスペプチンニューロンへ伝達するリガンド・受容体の探索
ソマトスタチンが、吸乳刺激を仲介し弓状核キスペプチンニューロンへ伝達するという仮説を立て、実験を行った。昨年度、泌乳期後半にソマトスタチン受容体2阻害剤の投与により、吸乳刺激によって抑制されたキスペプチン遺伝子Kiss1の発現細胞数が増加したこと、ならびに生殖機能の指標である血中黄体形成ホルモン濃度の上昇が確認されたことから、泌乳期後半にソマトスタチンが吸乳刺激をキスペプチンニューロンへ伝達し、Kiss1発現抑制に関与する可能性が示された。現在これらの結果について投稿論文を作成している。
②泌乳期Kiss1発現抑制のエピジェネティック制御機序の解明
吸乳刺激によるKiss1遺伝子発現抑制を制御するエピジェネティック制御因子を探索するため、泌乳期キスペプチンニューロン可視化ラットからのキスペプチンニューロンの単離を目指し実験を行った。昨年度はキスペプチンニューロン特異的タモキシフェン誘導性Creリコンビナーゼ発現ラットを作出したが、Cre遺伝子の発現が不十分であること確認したため、現在はタモキシフェン誘導性ではない、キスペプチンニューロン特異的Creリコンビナーゼ発現ラット作出に向け着々と準備が進んでいる。
以上より、本研究は泌乳中の繁殖機能抑制を担う中枢メカニズムの解明に向けおおむね順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究について、以下二つの推進方策を予定している。
①吸乳刺激をキスペプチンニューロンへ伝達するリガンド・受容体の探索
ソマトスタチンおよびTIP39が、吸乳刺激を仲介し脳弓状核キスペプチンニューロンへ伝達するという仮説を検証するため、それぞれについて次のような実験を実施する予定である。ソマトスタチンが吸乳刺激を仲介し泌乳ラット弓状核におけるキスペプチンニューロンへ入力する神経経路を明らかにするため、弓状核ソマトスタチン受容体2遺伝子およびキスペプチン遺伝子Kiss1の共発現について検討し、ソマトスタチンが直接キスペプチンニューロンへ作用する可能性について検証する。またキスペプチンニューロンへ促進的に作用することが示唆されているグルタミン酸作動性ニューロンのマーカーである小胞性グルタミン酸輸送体2遺伝子とSST受容体2遺伝子についても共発現を検討し、ソマトスタチンがグルタミン酸作動性ニューロンを介し、間接的にキスペプチンニューロンへ作用する可能性について検証する。またTIP39について、TIP39サポリンを泌乳ラット弓状核へ投与し、生殖機能の指標である血中黄体形成ホルモン濃度への影響を検討する予定である。
②泌乳期Kiss1発現抑制のエピジェネティック制御機序の解明
本年度はキスペプチンニューロン可視化ラットを作出し、泌乳中のラットから可視化されたキスペプチンニューロンを単離し、泌乳期特異的にキスペプチンニューロンにおいて発現するmRNAからcDNAライブラリを作成する予定である。ヒストン修飾因子や転写因子に着目したPCRアレイを行い、泌乳期のKiss1発現抑制に関与する候補因子を選別する予定である。なお、細胞単離の実験系は所属研究室においてすでに確立されているため、動物ができ次第、可視化キスペプチンニューロン単離実験を行う予定である。
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