2016 Fiscal Year Annual Research Report

標的分子と特異的に共有結合を形成する特殊ペプチドの探索

Research Project

Project/Area Number	16J05654
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	小澤直也東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 特別研究員(DC1)
Project Period (FY)	2016-04-22 – 2019-03-31
Keywords	特殊ペプチド / スクリーニング
Outline of Annual Research Achievements	今年度は、求電子剤を側鎖に持つアミノ酸（warhead）を含む環状ペプチドライブラリーを作製し、スクリーニングの条件検討を行った。まず、warhead含有ペプチドライブラリーの作製法を確立するための最初のステップとして、側鎖にカルバミン酸エステルを導入したwarheadアミノ酸をリボザイムを用いてtRNAに結合させ、無細胞翻訳系に導入した。反応性の異なる2種類のwarheadアミノ酸について十分な効率で翻訳反応が進行することを確認した。また、スクリーニングでは比較的高いpHと温度でライブラリーを処理するステップがあるが、この過程でwarheadが分子内反応や加水分解などによって失活する可能性が考えられた。そこで、翻訳合成したwarhead含有ペプチドがこの条件下で変化するか調べたところ、少量の分子内反応が見られたものの、いずれのwarheadについても大半は未反応であることがわかった。これらの結果を踏まえて、スクリーニングで使用するwarhead含有ペプチドライブラリーを設計して鋳型DNAを調製し、転写と翻訳を行ってペプチドライブラリーを合成した。次に、スクリーニング条件を最適化するために予備実験を行い、改善すべき点を2つ見出した。まず、スクリーニングにおいて鋳型DNAに塩基の挿入または欠失が発生し、ライブラリーが意図しない配列に変異することがわかったため、このような変異が起きにくいライブラリーに変更した。次に、標的タンパク質の固定化に使用している磁気ビーズとwarhead含有ペプチドが非特異的に反応し、偽陽性が発生する可能性が示唆されたため、スクリーニングの溶液にBSAを加えることで非特異的に反応を起こすペプチドを不活性化するなどの対策を検討している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度は、スクリーニングで使用するwarhead含有ペプチドライブラリーの作製法を確立することに成功した。さらに、このライブラリーを用いたスクリーニングの予備実験も行い、スクリーニングを実施するための準備が整った。したがって、研究は順調に進展していると考えている。
Strategy for Future Research Activity	今後は、予備実験の結果を踏まえて実際にスクリーニングを行い、標的タンパク質と共有結合を形成するペプチドを同定することを目指す。その後、同定されたペプチドについて、共有結合形成の速度と選択性、標的タンパク質に対する活性の評価を行う予定である。