2016 Fiscal Year Annual Research Report
新規パッケージング細胞を用いた次世代型アデノウイルスベクターの効率的な作製
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16J05920
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
若林 圭作 大阪大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | Adベクター / VA-RNA / shRNA / Dicer |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アデノウイルス(Ad)が発現する約160塩基の小分子RNAであるVirus-associated RNA(VA-RNA)は、I型インターフェロンの産生を誘導することで自然免疫を活性化することが報告されている。一方で研究代表者らはAdベクターを作用させた際に、in vitro, in vivo のいずれにおいても従来型Ad ベクターによる顕著なVA-RNA の発現が見られることを明らかにしている。従って、VA-RNAを欠損させたAdベクター(AdΔVRベクター)では、自然免疫応答の減弱と、それに伴う細胞性免疫の減弱および搭載遺伝子の発現延長が期待されることから、次世代型Adベクターとして有用であると考えられる。一方でこれまで、AdΔVRベクターの効率的な作製法は確立されていない。
そこで本研究では、AdΔVRベクターを効率的に作製すべく、Adベクター作製用のパッケージング細胞であるHEK293細胞の改良に取り組んだ。研究代表者らは、VA-RNAの機能解析を目的とした先行研究において、VA-RNAがマイクロRNA(miRNA)の成熟化を阻害すること、およびmiRNAの産生において重要な分子であるDicer をノックダウンした細胞でAd の増殖が顕著に促進されることが明らかにしている。これを応用し、Dicerに対するshort-hairpin RNA(shDicer)を安定発現しDicerを恒常的にノックダウンすることが可能な新規パッケージング細胞(293-shDicer細胞)を開発したところ、本細胞において従来型Adベクターと同様のプラスミドトランスフェクションによるAdΔVRベクターの産生がみられた。加えて、本細胞にAdΔVRベクターを再感染させることで、AdΔVRベクターをさらに増殖させることにも成功し、本細胞によってAdΔVRベクターの作製が可能になることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
293-shDicer細胞に、AdΔVRベクターを産生するプラスミドをトランスフェクションすることで、ウイルス粒子の産生を示す細胞変性効果（CPE）が見られることを確認した。プラスミドトランスフェクションによってCPEが起こった細胞を回収し、凍結融解処理によって細胞を破壊した。その後、上清を回収することで細胞内のウイルス粒子を回収し、これを293-shDicer細胞に再感染させることを試みた。その結果、レポーター遺伝子としてAdΔVRベクターに搭載したGFPが、再感染させた細胞においても発現し、さらにGFP発現細胞が増加するともに再びCPEが観察されたことから、本細胞を用いることでAdΔVRベクターの子孫ウイルス粒子が産生されていることが明らかとなった。そこで、従来型Adベクターの作製法に則り、本細胞を用いてAdΔVRベクターをさらに増殖させることを試みた。細胞数を増やしながら再感染を繰り返し、従来型Adベクターと同程度の細胞数までスケールアップすることに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、スケールアップしたAdΔVRベクターを従来型Adベクターと同様の方法(塩化セシウムを用いた密度勾配遠心)で精製することを試み、精製したウイルスの収量や感染力価を評価する。また、AdΔVRベクターの有用性を示すために、AdΔVRベクターをin vitroで感染させた細胞や、AdΔVRベクターを全身または局所投与したマウスの血清中及び各臓器における炎症性サイトカインの産生を評価する。
これと並行して、VA-RNAの機能解析にも取り組む。近年、VA-RNAがmiRNA と同様の機構でプロセシングを受け、VA-RNA由来miRNA (mivaRNA) を産生することが明らかとなっており、本研究では、mivaRNAの標的遺伝子を同定するなどしてその機能を明らかとすることを試みる。本研究によってVA-RNAの生理機能の解析が進めば、Adベクターやパッケージング細胞の改良など、さらなる基盤技術の開発にも応用できるものと期待される。
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