2016 Fiscal Year Annual Research Report
胎生期の脳発生過程におけるミクログリアの機能と母体炎症による影響の解明
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16J06207
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
服部 祐季 名古屋大学, 医学系研究科, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | ミクログリア / 脳発生 / 神経前駆細胞 / 胎生期 / 大脳 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウス胎生期の大脳皮質原基におけるミクログリアの分布・移動および機能について解析を行った。特に胎生中期に注目し、ミクログリアの時期依存的な分布変化や動態を、免疫組織化学および脳原基スライス培養によるライブイメージングにて網羅的に調べ、ミクログリアが特定の時期にある方向性を持って移動・集積する傾向を捉えた。またこれには、ケモカインシグナルが関与していることを明らかにした。具体的には、ケモカインレセプターに対するアンタゴニストを用いた脳原基スライス培養ライブイメージングや脳より単離したミクログリアと脳組織片の共培養実験を用いた解析による。
また、より生体内の状況を模した観察を遂行する為、新たに二光子顕微鏡を用いたライブイメージング法を確立した。これは、母体につながった状態のままの胎仔の脳内ライブイメージングを目指した観察法であり、胎仔を子宮内に留めて母体からの血流を維持したまま、胎仔脳内の細胞の動きを観察することを目指している。試行検討の末、観察に必要な条件（母体の子宮に対する外科的処理方法、適切な固定器具の作製、母体・胎仔の体温管理等）を整えた。この観察法にて胎生期脳内のミクログリアの動態を捉えることを達成し、これまでに脳原基スライス培養で観察したミクログリアの特徴的な移動傾向も認めることができた。
さらに、ミクログリアの神経系中間前駆細胞に対する機能解析にも着手し、ミクログリアの神経系前駆細胞の産生・運命選択への関与について新しい知見を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、マウス胎生中～後期の大脳皮質原基におけるミクログリアの時期依存的な分布変化や動態を、免疫組織化学および脳原基スライス培養によるライブイメージングを通じて把握し、ミクログリアの特徴的な移動傾向、またそれに関わるケモカインシグナルの存在を明らかにした。
胎仔脳内のライブイメージングに関しては、取り出した脳原基をスライスし、培養下で共焦点レーザー顕微鏡による観察を進めてきたが、組織の切断や血管の破綻による影響が否めなかった。そこで、本課題が目指す「二光子顕微鏡を用いた胎仔脳内ライブ観察」について、本年度はこの基盤確立に向け最適な手法を模索した。まず、母体管理に必要な器具・条件（保温器による体温維持、吸入麻酔の条件）を整えた。さらに、胎児の適切な固定法および母体の子宮の可動域を増すための外科的手術法を確立し、観察の際に問題であった母体・胎仔由来の揺動をほぼ完全に抑えることができた。この観察法にて、胎生中～後期における胎仔脳内ミクログリアの数時間に及ぶライブ観察が達成できている。
期間全体を通じての達成目標である「ミクログリアと神経前駆細胞の相互作用をライブイメージングで捉える」ことに関しては、技術的難点を把握し、それに対する方策を練った。ミクログリアの機能解析については、胎仔大脳より単離したミクログリアと神経系前駆細胞との共培養実験、ミクログリアの活性化・非活性化・除去など新しい試験法を確立し、これらによる解析からミクログリアが神経系前駆細胞の産生・運命選択に関与することを示唆する結果を得た。
これまでの研究成果については、日本神経科学学会（2016年7月）、日本分子生物学会（2016年12月）にて発表し、論文執筆に取り掛かった。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでにミクログリアの時期依存的な分布変化や動態を捉え、ミクログリアの移動にはあるケモカインシグナルが重要であることを示唆する結果を得ている。現在、ケモカインレセプターのノックアウトマウスの交配を進めており、解析準備が整えば今後はノックアウトマウスを用いてこのケモカインシグナルがミクログリアの分布・移動に関与しているかを明らかにする。
二光子顕微鏡を用いた胎仔脳内ライブイメージング法に関しては、現時点ではまだ数時間以内の観察しか達成できていない。また、単色での観察（ミクログリア）に留まっている。そこで、より長時間のライブ観察が達成できるよう観察条件の改善を試みるとともに、神経前駆細胞や血管などを別の色にラベルし、ミクログリアとの二色同時ライブ観察を目指す。
ミクログリアの神経系中間前駆細胞に対する機能についてもさらに解析を継続する。脳原基スライス培養および二光子顕微鏡を用いたライブイメージングのそれぞれの観察法で、ミクログリアと神経前駆細胞の動態を把握し、両者の接触の有無とミクログリアの挙動変化および神経前駆細胞の産生・運命選択の関係性について詳細に調べ、接触パターンや時間軸の観点からこれを明らかにする。
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Research Products
(3 results)
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[Journal Article] Sustained inflammation after pericyte depletion induces irreversible blood-retina barrier breakdown.2017
Author(s)
Ogura S, Kurata K, Hattori Y, Takase H, Ishiguro-Oonuma T, Hwang Y, Ahn S, Park I, Ikeda W, Kusuhara S, Fukushima Y, Nara H, Sakai H, Fujiwara T, Matsushita J, Ema M, Hirashima M, Minami T, Shibuya M, Takakura N, Kim P, Miyata T, Ogura Y, Uemura A.
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Journal Title
JCI Insight
Volume: 2(3)
Pages: e90905
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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