2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of highly efficient plant genome editing tools using CRISPR/Cas9
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16J06425
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
三上 雅史 横浜市立大学, 生命ナノシステム科学研究科, 特別研究員(DC1)
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2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物におけるCRISPR/Cas9を用いた発現系において、SpCas9/gRNA発現ベクターをDNAとして植物に導入する際、RNAの5´末端と3´末端に修飾がされないRNA polymerase III (pol III) 制御下にあるプロモーターでgRNAを発現させる方法が一般的となっている。しかし、pol IIIプロモーターの知見は乏しい。そのため、RNA polymerase II (pol II) 制御下にあるプロモーターで発現させたRNAから、RNA-cleaving enzymes等 (e.g. Csy4, tRNA, ribozyme) を用いることで、キャップ構造やポリ (A) 鎖等の修飾を除いて、機能的なgRNAを生成する系が植物でも報告されている。
本年度の研究では、SpCas9タンパク質の存在下において、内在性のRNases等によるRNAプロセシングによって、RNA-cleaving enzymes等の認識配列を必要としなくても、機能的なgRNAが生成され、ゲノム編集ができることを明らかにした。本研究で作成したリボザイムの配列を含まないSpCas9-gRNAベクターを用いたゲノム編集は、イネとシロイヌナズナにおいて成功した。そのため、植物において普遍的にgRNAを生成できる可能性が示唆された。また、SpCas9-gRNAベクターを用いて、組織特異的や誘導的プロモーターによる高度なゲノム編集系のブラッシュアップも同時に行った。誘導系において、蛍光タンパク質であるGFP遺伝子をつないだGFP-SpCas9-gRNAベクターを作成した。この発現ベクターではGFPの蛍光をモニタリングすることで、ゲノム編集が起きた系統を容易に選択することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度では前年度に作成したSpCas9-rz-gRNAベクターにおいて、リボザイムが機能的に働いてgRNAを生成していることを示すために、コントロールベクターとして作成したSpCas9-gRNAベクターを作成した。このSpCas9-gRNAベクターをイネカルスに形質転換し、CRISPR/Cas9による標的変異の有無を確認したところ、SpCas9-rz-gRNAと同程度の高効率な標的変異効率を示していた。また、gRNAのノーザンブロット解析において、SpCas9-gRNAベクターを形質転換したカルスから、機能的と考えられるgRNAのシグナルが確認された。このgRNAのシグナルはSpCas9が発現している場合で、強いシグナルを示し、SpCas9タンパク質の存在によってgRNAが生成されていることをイネカルスで確認した。このことから、リボザイムが無くても、機能的なgRNAが生成される過程には、SpCas9タンパク質の存在が必須であると考え、in-vitroのCRISPR/Cas9 cleavage assayを試みた。その結果、gRNA配列を含むがribozyme配列がない約1kbのRNAとSpCas9タンパク質を用いた場合は、DNAの切断は行われなかった。しかしながら、RNAをランダムで切断するRNase IIIやRNase T1をさらに加えて、in-vitro cleavage assayを行うと、DNAの切断が行われるようになった。植物細胞内では、gRNAとしての活性がないgRNA配列を含むRNAは、内在性のRNases等によるRNAの分解とSpCas9によるgRNAの分解の保護が協調的に働きによって、機能的なgRNAが生成させるメカニズムを発見し、論文を発表した。組織特異的や誘導的プロモーターへの応用研究も計画通りに進んでいるため、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度では、シロイヌナズナで組織特異的なゲノム編集を、イネにおいて誘導的なゲノム編集を行い、成功したが、効率が悪かった。そこで、本年度は、SpCas9-gRNAベクターを用いて、組織特異的や誘導的プロモーターによる高度なゲノム編集系のブラッシュアップも同時に行った。シロイヌナズナにおいては、組織特異的プロモーターの中でも茎頂分裂組織や減数分裂時等で発現するプロモーターを計５つ試した。また、イネにおいては、β-Estradiolによる誘導をモニタリングするために、蛍光タンパク質であるGFP遺伝子をつないだGFP-SpCas9-gRNAベクターを作成した。このベクターではβ-Estradiolを処理した際に、発現誘導されたGFPの蛍光強度を観察することで、SpCas9とgRNAの発現量が高い系統を選抜することができると考えた。実際に、このGFP-SpCas9-gRNAベクターを形質転換したイネカルスにおいて、β-Estradiolの処理時に、GFPの蛍光を観察し、発現誘導がされている系統を選抜することで、ゲノム編集が起きているイネカルスの系統を容易に選択することができた。しかしながら、いずれにおいても恒常的プロモーターに比べ、ゲノム編集効率は低く、効率を大きく向上させることができなかった。
今後は、発現がさらに高いプロモーターを用いるとともに、二重の誘導系を用いることで、ブラッシュアップを試みる。また、SpCas9-gRNAベクターではSpCas9とgRNAを同時に発現することができるため、変異導入だけではなく、塩基置換や遺伝子のノックインが可能なGene Targetingに適している可能性が示唆される。そのため、SpCas9-gRNAベクターを用いたGene Targeting系の構築も行い、より高精度なゲノム編集系の確立を目指す。
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