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2017 Fiscal Year Annual Research Report

Development of highly efficient plant genome editing tools using CRISPR/Cas9

Research Project

Project/Area Number 16J06425
Research InstitutionYokohama City University

Principal Investigator

三上 雅史  横浜市立大学, 生命ナノシステム科学研究科, 特別研究員(DC1)

Project Period (FY) 2016-04-22 – 2019-03-31
Keywordsゲノム編集 / CRISPR/Cas9
Outline of Annual Research Achievements

植物におけるCRISPR/Cas9を用いた発現系において、SpCas9/gRNA発現ベクターをDNAとして植物に導入する際、RNAの5´末端と3´末端に修飾がされないRNA polymerase III (pol III) 制御下にあるプロモーターでgRNAを発現させる方法が一般的となっている。しかし、pol IIIプロモーターの知見は乏しい。そのため、RNA polymerase II (pol II) 制御下にあるプロモーターで発現させたRNAから、RNA-cleaving enzymes等 (e.g. Csy4, tRNA, ribozyme) を用いることで、キャップ構造やポリ (A) 鎖等の修飾を除いて、機能的なgRNAを生成する系が植物でも報告されている。
本年度の研究では、SpCas9タンパク質の存在下において、内在性のRNases等によるRNAプロセシングによって、RNA-cleaving enzymes等の認識配列を必要としなくても、機能的なgRNAが生成され、ゲノム編集ができることを明らかにした。本研究で作成したリボザイムの配列を含まないSpCas9-gRNAベクターを用いたゲノム編集は、イネとシロイヌナズナにおいて成功した。そのため、植物において普遍的にgRNAを生成できる可能性が示唆された。また、SpCas9-gRNAベクターを用いて、組織特異的や誘導的プロモーターによる高度なゲノム編集系のブラッシュアップも同時に行った。誘導系において、蛍光タンパク質であるGFP遺伝子をつないだGFP-SpCas9-gRNAベクターを作成した。この発現ベクターではGFPの蛍光をモニタリングすることで、ゲノム編集が起きた系統を容易に選択することができた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度では前年度に作成したSpCas9-rz-gRNAベクターにおいて、リボザイムが機能的に働いてgRNAを生成していることを示すために、コントロールベクターとして作成したSpCas9-gRNAベクターを作成した。このSpCas9-gRNAベクターをイネカルスに形質転換し、CRISPR/Cas9による標的変異の有無を確認したところ、SpCas9-rz-gRNAと同程度の高効率な標的変異効率を示していた。また、gRNAのノーザンブロット解析において、SpCas9-gRNAベクターを形質転換したカルスから、機能的と考えられるgRNAのシグナルが確認された。このgRNAのシグナルはSpCas9が発現している場合で、強いシグナルを示し、SpCas9タンパク質の存在によってgRNAが生成されていることをイネカルスで確認した。このことから、リボザイムが無くても、機能的なgRNAが生成される過程には、SpCas9タンパク質の存在が必須であると考え、in-vitroのCRISPR/Cas9 cleavage assayを試みた。その結果、gRNA配列を含むがribozyme配列がない約1kbのRNAとSpCas9タンパク質を用いた場合は、DNAの切断は行われなかった。しかしながら、RNAをランダムで切断するRNase IIIやRNase T1をさらに加えて、in-vitro cleavage assayを行うと、DNAの切断が行われるようになった。植物細胞内では、gRNAとしての活性がないgRNA配列を含むRNAは、内在性のRNases等によるRNAの分解とSpCas9によるgRNAの分解の保護が協調的に働きによって、機能的なgRNAが生成させるメカニズムを発見し、論文を発表した。組織特異的や誘導的プロモーターへの応用研究も計画通りに進んでいるため、おおむね順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

前年度では、シロイヌナズナで組織特異的なゲノム編集を、イネにおいて誘導的なゲノム編集を行い、成功したが、効率が悪かった。そこで、本年度は、SpCas9-gRNAベクターを用いて、組織特異的や誘導的プロモーターによる高度なゲノム編集系のブラッシュアップも同時に行った。シロイヌナズナにおいては、組織特異的プロモーターの中でも茎頂分裂組織や減数分裂時等で発現するプロモーターを計5つ試した。また、イネにおいては、β-Estradiolによる誘導をモニタリングするために、蛍光タンパク質であるGFP遺伝子をつないだGFP-SpCas9-gRNAベクターを作成した。このベクターではβ-Estradiolを処理した際に、発現誘導されたGFPの蛍光強度を観察することで、SpCas9とgRNAの発現量が高い系統を選抜することができると考えた。実際に、このGFP-SpCas9-gRNAベクターを形質転換したイネカルスにおいて、β-Estradiolの処理時に、GFPの蛍光を観察し、発現誘導がされている系統を選抜することで、ゲノム編集が起きているイネカルスの系統を容易に選択することができた。しかしながら、いずれにおいても恒常的プロモーターに比べ、ゲノム編集効率は低く、効率を大きく向上させることができなかった。
今後は、発現がさらに高いプロモーターを用いるとともに、二重の誘導系を用いることで、ブラッシュアップを試みる。また、SpCas9-gRNAベクターではSpCas9とgRNAを同時に発現することができるため、変異導入だけではなく、塩基置換や遺伝子のノックインが可能なGene Targetingに適している可能性が示唆される。そのため、SpCas9-gRNAベクターを用いたGene Targeting系の構築も行い、より高精度なゲノム編集系の確立を目指す。

  • Research Products

    (8 results)

All 2018 2017

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 1 results) Presentation (5 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results)

  • [Journal Article] Simultaneous site-directed mutagenesis of duplicated loci in soybean using a single guide RNA2018

    • Author(s)
      Kanazashi Yuhei、Hirose Aya、Takahashi Ippei、Mikami Masafumi、Endo Masaki、Hirose Sakiko、Toki Seiichi、Kaga Akito、Naito Ken、Ishimoto Masao、Abe Jun、Yamada Tetsuya
    • Journal Title

      Plant Cell Reports

      Volume: 37 Pages: 553~563

    • DOI

      10.1007/s00299-018-2251-3

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Re-evaluation of the rin mutation and the role of RIN in the induction of tomato ripening2017

    • Author(s)
      Ito Yasuhiro、Nishizawa-Yokoi Ayako、Endo Masaki、Mikami Masafumi、Shima Yoko、Nakamura Nobutaka、Kotake-Nara Eiichi、Kawasaki Susumu、Toki Seiichi
    • Journal Title

      Nature Plants

      Volume: 3 Pages: 866~874

    • DOI

      10.1038/s41477-017-0041-5

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] In Planta Processing of the SpCas9-gRNA Complex.2017

    • Author(s)
      Mikami Masafumi、Toki Seiichi、Endo Masaki
    • Journal Title

      Plant and Cell Physiology

      Volume: 58 Pages: 1857~1867

    • DOI

      10.1093/pcp/pcx154.

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] NGのPAMを認識するSpCas9変異体を用いた植物のゲノム編集2018

    • Author(s)
      三上雅史、遠藤真咲、遠藤亮、賀屋秀隆、伊藤剛、西増弘志、濡木理、土岐精一
    • Organizer
      日本育種学会第132回講演会
  • [Presentation] 内在性RNases依存的なRNAプロセシングを利用したCRISPR/Cas9による標的変異2017

    • Author(s)
      三上雅史、遠藤真咲、土岐精一
    • Organizer
      日本育種学会第132回講演会
  • [Presentation] 内在性RNases依存的なRNAプロセシング機構によるgRNAの生成2017

    • Author(s)
      三上雅史、遠藤真咲、土岐精一
    • Organizer
      第35回日本植物細胞分子生物学会
  • [Presentation] Application of SaCas9 and FnCpf1 for genome editing in plants2017

    • Author(s)
      Mikami Masafumi、Endo Masaki、Endo Akira、Kaya Hidetaka、Toki Seiichi
    • Organizer
      Taiwan-Japan Plant Biology 2017
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Genome editing in rice and tobacco using Staphylococcus aureus Cas9 and Francisella novicida Cpf12017

    • Author(s)
      Mikami Masafumi、Endo Masaki、Endo Akira、Kaya Hidetaka、Toki Seiichi
    • Organizer
      Plant Genome Editing and Genome Engineering of Vienna International Science Conferences and Events Association
    • Int'l Joint Research

URL: 

Published: 2018-12-17  

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