2016 Fiscal Year Annual Research Report
神経樹状突起内ｍＲＮＡ輸送・局所的翻訳による学習・記憶の分子機構
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16J07985
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| Research Institution | The Graduate University for Advanced Studies |
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Principal Investigator |
大橋 りえ 総合研究大学院大学, 生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
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2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | 局所的翻訳 / mRNA輸送 / 樹状突起 / RNG105 / Arf制御因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経樹状突起へのmRNA輸送とシナプス刺激依存的な局所的翻訳は、学習・記憶に必須であることが示唆されており、この分子機構の解明は記憶形成の理解の進展において重要な課題である。本研究では、樹状突起へのmRNA輸送を担い、欠損マウスで記憶が顕著に低下する分子としてRNG105に着目した。これまでに、RNG105欠損マウスの海馬樹状突起において局在が低下するmRNAとして、Arf制御因子 (GAP, GEF) をコードするmRNA (9種類) を同定した。これらmRNA群の局所的翻訳がシナプス可塑性および記憶に与える影響を明らかにすることを目的として研究を進めている。
平成28年度は、Arf制御因子mRNA群のRNG105との結合、樹状突起への輸送の2点について解析を行った。成体の野生型マウス大脳から抗RNG105抗体により免疫沈降を行い、qRT-PCRにより各Arf制御因子mRNAを定量した。その結果、各Arf制御因子mRNAはRNG105と結合していることを明らかにした。
次に、神経初代培養系においてMS2システムにより樹状突起へのmRNA輸送を解析した。MS2結合配列と各Arf制御因子mRNAの全長を繋いだコンストラクトを作製し、これらとMS2-GFPをマウス大脳由来神経初代培養細胞に共導入し、GFPを指標としてmRNAを可視化した。更に、KCl添加により脱分極を誘導し、樹状突起へ輸送される条件を検討した。その結果、野生型ニューロンでは、Arf制御因子mRNA群はその種類によりKCl刺激依存的または非依存的に樹状突起へ輸送されることを見出した。また、RNG105欠損ニューロンでは樹状突起への輸送が低下する傾向が見られた。
以上のことから、Arf制御因子mRNA群は神経活動依存的または非依存的に樹状突起へ輸送され、その輸送にはRNG105が関与することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画に従って、Arf制御因子mRNA群とRNG105との結合解析、および、mRNA群の樹状突起への輸送解析を行った。免疫沈降と定量的RT-PCRにより、Arf制御因子mRNA群がRNG105と結合していることを明らかにした。また、神経初代培養細胞においてMS2システムによるmRNA可視化により、Arf制御因子mRNA群は野生型ニューロンにおいて神経活動依存的または非依存的に樹状突起へ輸送されること、RNG105欠損ニューロンでは輸送が低下することを明らかにした。更に、Arf制御因子mRNA群の樹状突起への輸送責任cis配列決定に必要なコンストラクト作製に着手した。以上のことから、本研究は概ね計画通りに進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
Arf制御因子mRNA群はRNG105と結合し、樹状突起へ輸送されることを明らかにした。次の段階として、それらmRNAの樹状突起への輸送責任cis配列を決定する。また、Arf制御因子mRNA群のシナプス刺激依存的な翻訳を可視化により解析する（平成29年度）。更に、Arf制御因子mRNAの局所的翻訳が、シナプス反応性制御の鍵であるAMPA受容体細胞表面提示、および、個体レベルでの学習・記憶に与える影響を解析する（平成30年度）。
輸送責任cis配列決定に用いるArf制御因子mRNA群の様々な欠失変異体の作製には既に着手している。それらのコンストラクトを神経初代培養細胞に導入し、MS2システムによるmRNA輸送解析を昨年度同様に行い、輸送の有無を解析する。
翻訳の可視化は、神経初代培養細胞を用い、ルシフェラーゼ発光を利用した系を検討する。当初の研究計画ではTRICK法を用いる予定であったが、その後新たに発光による翻訳可視化の系が報告され、神経活動依存的な翻訳を継時的に検出することを目的とする本研究の遂行にあたり、より適切であると考えた。神経初代培養細胞にTEAを添加して細胞レベルでのLTPを誘導し、Arf制御因子群の新規タンパク質合成を発光シグナルを指標に可視化する。また、2光子励起ケイジドグルタミン酸法により単一スパインを刺激し、同様に発光の系によりArf制御因子mRNA群の翻訳を可視化する。
AMPA受容体への影響は、内在性Arf制御因子mRNA群をノックダウンし、輸送責任cis配列のみを欠いたコンストラクトを発現させ、AMPA受容体の細胞表面提示をpH感受性GFPフルオリン-AMPA受容体により検出する。また、輸送責任cis配列を欠損させたマウスを作製し、学習・記憶への影響を解析する。そのために、輸送責任cis配列決定後、CRISPR/Cas9を用いた変異マウス作製に着手する。
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