2017 Fiscal Year Annual Research Report
単一細胞の経時的な解析が解き明かす、初期発生における未分化と分化の切り替え機構
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16J08005
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| Research Institution | National Institute for Basic Biology |
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Principal Investigator |
中能 祥太 基礎生物学研究所, 初期発生研究部門, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | ヒト多能性細胞 / 細胞周期 / 多能性 / 分化 / CRISPR/Cas9 / pOPTiKD |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、各種のシグナル経路と細胞周期制御因子に注目することで、哺乳類初期発生の新たな側面を明らかにし、多能性と分化を制御する機構を深く理解することを目指す。これまで、遺伝子単位での機能喪失と大規模シーケンサーによる網羅的解析が比較的容易であるin vitroの系を利用するため、シグナル経路と細胞周期制御因子の関連を解明し、哺乳類多能性細胞の着床前後に起こる分化ポテンシャルの変化を世界で初めて報告したイギリス・ケンブリッジ大学の研究者と共同研究を進めてきた。2年目となる2017年度には、今後の分子機構の解明に向けた土台作りとして、共同研究先の研究室に滞在してヒト多能性幹細胞を用いたin vitroの系の樹立に注力した。
まず滞在研究室で確立されていた技術を活かして細胞周期を制御する遺伝子を欠損したヒトES細胞の作出を試みた。機能重複している遺伝子ファミリーの内1つを残してCRISPR/Cas9法によって欠損させることに成功し、残り1つの遺伝子についてはshRNAに基づいたpOPTiKDのシステムを用いてinducible knock downができるようにした。
また、哺乳類の多能性状態を制御する重要なシグナルであるFGF/ERKシグナルとTGFb/SMADシグナルが細胞状態の維持や変化にどう関与するのかを詳しく調べるため、特異性の高い遺伝学的な機能阻害システムの開発に着手した。すでに単独遺伝子を高効率で阻害するshRNAの選定を終え、現在はそれらを組み合わせたinducible knock downの系の樹立に取り掛かっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マウス胚の画像解析から始まった本研究課題は、細胞周期と分化能の関連を分子レベルで明らかにするため、実験操作と解析の選択肢がより多いin vitroの系へと比重を移してきた。
遺伝子操作を行ったヒト多能性幹細胞の樹立には技術的な問題から予想よりも長い時間を要したものの、標的遺伝子の複数欠損細胞株の樹立に成功し、inducible knock downの導入についても現在進行形で取り組んでいる。標的遺伝子の機能阻害に必要な効きの良いshRNAの選出も既に終えているので、期待する細胞株の樹立は近いと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
樹立した細胞株を足がかりとして、標的遺伝子が関与する現象の把握とその背後にある分子機構の解析へと進むことができるようになると期待している。引き続き共同研究先で実験を進めることで、in vitroでの分化誘導やリプログラミング技術を活用して体系的・効率的な表現系アッセイを行うとともに、シーケンスやさらなる遺伝子操作によって分子機構の解明を目指す。
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