2016 Fiscal Year Annual Research Report
求核付加・解離平衡に基づく多色・多機能な超解像蛍光イメージングプローブ群の開発
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16J08291
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
両角 明彦 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | 蛍光プローブ / 超解像イメージング / キサンテン系色素 / グルタチオン / 求核付加・解離 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
SMLMは蛍光色素を確率的に明滅させることで超解像蛍光画像を構築する手法である。本研究では、細胞内グルタチオンの求核付加・解離平衡による新規明滅原理に基づく多色・多機能なSMLM用色素の開発に取り組む。昨年度までに、上記明滅原理に基づくSMLM用色素の候補として、2色の色素SiP650, CP550を見出した。さらに、各色素の誘導体を用いて固定細胞でのSMLMを達成した。
本年度は、これらの色素を生細胞に適用した。生細胞内の標的タンパク質を特異的にラベルする手段としては、汎用のタンパク質タグであるHalo Tag, SNAP-tagを用いた。各タグタンパク質に特異的に結合する構造を導入した色素誘導体群を合成し、生細胞に適用した。標的としては、微小管のtubulinを選択した。その結果、特にHalo Tag融合tubulinに対しCP550誘導体(CP550-Halo)を適用した系で、微小管が特異的にラベルされ、添加物や強いレーザー光照射なしに適切な明滅が見られ、微小管の超解像画像が構築できた。CP550-Haloは、当研究室が以前に開発したSMLM用赤色蛍光色素HMSiRに並ぶ2色目のSMLM用色素として有用性が高い。そこで、本年度はCP550-Haloのさらなる応用、特にHMSiRとの併用による生細胞2色SMLMへの応用に注力した。まず、生きた哺乳類細胞において、2種の標的タンパク質を、Halo TagおよびSNAP-tagを利用してそれぞれCP550-Halo, HMSiR-Haloでラベルし、生細胞2色SMLMが可能であることを実証した。さらに、新たな実験系として、バクテリアにおける生細胞2色SMLMにも着手した。ここでは、生きたバクテリア細胞の細胞内微小構造体と細胞膜を標的とした2色SMLMを行っている。現在までに両標的のラベリングと2色SMLMに成功している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度は主に、これまで新規設計指針に則り開発を進めてきたSMLM用蛍光色素の生細胞への適用に取り組み、特に黄緑色蛍光色素CP550の生細胞SMLMへの応用を成功させた。当研究室が先行研究において開発した赤色蛍光色素HMSiRに続く2色目のSMLM用蛍光色素は、多色観察等の観点から、その開発が強く求められながらも、HMSiRの設計戦略を踏襲するだけでは実現されなかったものである。今回、新たな設計原理に基づきこれを開発したことは、化学的にも実使用上の観点からも非常に重要であり、高く評価されると考えている。さらに、これらのSMLM用色素を利用する応用実験系の開拓を進めたことも特筆に値する。当研究室で扱いうるSMLM実験の対象として哺乳類細胞だけでなくバクテリア細胞が加わり、さらにそれらの2色観察も可能になった。このような本年度の成果の上に、次年度以降は、新規プローブ分子の開発およびその生物学的応用の両面において、さらなる進展が期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度以降は、現在進行中である上記のバクテリアの生細胞2色SMLM系において、さらに3次元観察や経時観察を行うことで、細胞内構造体と細胞外形の形態や動態を互いに関連づけながら詳細に解析していく。また、共同研究等も含め、CP550-Haloをその他の様々な観察実験系に応用し、その適用範囲の拡張を図る。加えて、CP550-SNAPおよびSiP650誘導体の生細胞適用に向けた検討、またphotoactivatable型プローブの開発研究にも並行して取り組む予定である。
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