2017 Fiscal Year Annual Research Report
ネコモルビリウイルスによる間質性腎炎発症機構の解明とワクチンによる予防法の確立
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16J08397
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
坂口 翔一 東京農工大学, 農学部附属国際家畜感染症防疫研究教育センター, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | 猫 / モルビリウイルス / パラミクソウイルス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、ネコモルビリウイルスによる腎炎発症機構の解明である。ネコモルビリウイルス持続感染機構の解析のため、ネコモルビリウイルスの持続感染細胞の樹立および、猫に感染性のネコモルビリウイルスが1年以上感染し続けていることを明らかにした。具体的には、持続感染細胞における免疫応答、ウイルス産生能の比較、形態学的解析を行い、この細胞の性状を明らかにした。また、ネコモルビリウイルスに感染したネコを継続的に観察し、最初のウイルス分離から1年後、再度分離することに成功した。今回の結果から、感染性のネコモルビリウイルスが猫に1年以上にわたり持続感染していることが初めて示された。また樹立した持続感染細胞は、そのメカニズムを調べるためのin vitroモデルとして重要である。
2015年にネコモルビリウイルスではない、猫に感染するパラミクソウイルス（ネコパラミクソウイルス）が尿路疾患に関係することが報告された。我々は日本において、猫の尿路疾患とウイルス感染の関係を調べるために、感染率および分布を調べ、その一部の成果を報告した。またこのウイルスゲノムについてはごく一部のみがわかっていたが、我々は次世代シークエンスを用い、ネコパラミクソウイルスのゲノム構造を明らかにした。さらに、このゲノム情報を用い、近縁のウイルスとの系統関係をより明確にした。本結果から、日本の猫に少なくとも2種のパラミクソウイルスが感染しており、これらウイルスが猫や人に与える影響を研究する必要性が示された。
2016年に猫の急性腎不全にマクロファージのアポトーシス阻害因子が関与すると報告された。ネコモルビリウイルス感染との関係を調べるため、この因子の進化的な解析を行った。先行研究で、猫において機能的な差異が認められたモチーフについて調べたが、正の自然選択は認められなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は3年目に計画しているネコモルビリウイルス持続感染機構の解析を行うため、ネコモルビリウイルスの持続感染細胞を樹立し、持続感染細胞における免疫応答、ウイルス産生能の比較、形態学的解析を行い、この細胞の性状を明らかにした。また、持続感染細胞を用いたミニレプリコンの作製を試み、蛍光タンパク質の発現を確認した。これまで分離したネコモルビリウイルス全株で持続感染細胞を樹立した。また、ネコモルビリウイルスに感染したネコを継続的に観察し、最初のウイルス分離から1年後、再度分離することに成功し、感染性のネコモルビリウイルスが長期間に渡って持続感染していることを明らかにした。一方で、ウイルス感染で特異的に発現するmiRNAの同定には至らなかった。
我々が日本で初めて分離したネコパラミクソウイルス（ネコモルビリウイルスとは異なるが、腎不全への関与が報告されている）のゲノム構造の決定を試みた。その結果、ほぼ全長を解読することに成功し、遺伝子の構造が明らかとなった。これを用いた系統解析によって、近縁のウイルスとの系統関係を明らかにした。
猫の腎不全に関与するとされる、マクロファージのアポトーシス阻害因子の進化的な解析を行った。具体的には、先行研究で機能的な差異が認められたネコにおけるモチーフ配列について非同義置換率と同義置換率を比較した。生存に有利な変異（正の自然選択）が起こっていると予想していたが、統計的な有意差は得られなかった。
猫に感染するウイルスの網羅的・迅速診断システムを構築する前段階として、細菌の検出ではすでに実績がある、小型次世代シークエンサーを用いた迅速診断系のウイルス配列への応用を試みた。複数のウイルスゲノム配列の一部を合成し、この合成オリゴをPCRによって増幅したアンプリコンを解析したところ、短時間で全てのウイルスゲノム配列を検出することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず3年目の計画である、次世代シークエンサーを用いたネコモルビリウイルスの持続感染機構の解析を行う。具体的には、2年目にみつかった持続感染個体から経時的に採取した尿中のウイルス配列の変化を調べる。また、同じく2年目に樹立した持続感染細胞中で増殖するウイルスの配列を調べ、接種したウイルスのゲノム配列と比較する。これらによって、持続感染に重要なアミノ酸配列を明らかにする。
また感染実験による体内動態の解析を行う。引き続き、リバースジェネティクス技術を用いたネコモルビリウイルスの人工合成系の改良に取り組み、作出した組換えウイルスを猫に接種し、ウイルスゲノムの検出や病理学的解析を行う。また、げっ歯類由来細胞を用いて分離したネコモルビリウイルスについて、げっ歯類を用いた感染モデルの作出も試みる。
さらに、2年目の計画に引き続き、受容体の解明に取り組む。ネコモルビリウイルス非感受性細胞に猫型のSLAMまたはNECTIN4を発現させ、この細胞にネコモルビリウイルスを接種することで感染性の有無を確かめる。一方、ここで作製した細胞を用い、ネコパラミクソウイルスの分離も試みる。
加えて、ネコパラミクソウイルスの系統関係をさらに詳しく解析する。猫に感染するパラミクソウイルスが、パラミクソウイルス全体の中でどのような進化的位置関係にあるのかを解析する。また、猫マクロファージのアポトーシス阻害因子をさらに解析し、ウイルス感染に対し適応的な進化があったのか調べる。これらを通じて、猫が進化の過程でパラミクソウイルスに対抗するためにどのような変異を獲得してきたのか考察する。
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Research Products
(5 results)
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[Journal Article] Genetic diversity and recombination of enterovirus G strains in Japanese pigs: High prevalence of strains carrying a papain-like cysteine protease sequence in the enterovirus G population2018
Author(s)
Tsuchiaka S., Naoi Y., Imai R., Masuda T., Ito M., Akagami M., Ouchi Y., Ishii K., Sakaguchi S., Omatsu T., Katayama Y., Oba M., Shirai J., Satani Y., Takashima Y., Taniguchi Y., Takasu M., Madarame H., Sunaga F., Aoki H., Makino S., Mizutani T., Nagai M.
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Journal Title
PLOS ONE
Volume: 13
Pages: e0190819
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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