2016 Fiscal Year Annual Research Report
腫瘍微小環境におけるマクロファージの生体内ＦＲＥＴイメージングによる解析
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16J09066
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
小西 義延 京都大学, 医学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | FRETバイオセンサー / ERK / ROSA26 locus / 相同組換え / Tol2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
◆トランスジェニックマウス作成
当初の研究計画ではERK活性をモニターするFRETバイオセンサーを全身に発現させた遺伝子組み換えマウスより骨髄造血幹細胞を回収し、単球/マクロファージ特異的プロモーター制御下にマーカー遺伝子を導入後、レシピエントマウスに移植、イメージング利用する方針としていた。しかし、従来のFRETマウスの単球、マクロファージ、リンパ球といった血液細胞におけるバイオセンサー発現は非常に弱く、ERK活性をモニターする上で信頼にたる輝度ではなかった。従来のFRETマウスはTol2依存性に遺伝子導入を行っており、ランダムに遺伝子が入った結果、元々血球系で発現の弱いCAGプロモーターの発現が部位に依り更に抑制されてしまったためと考えられた。そこで新たなトランスジェニックマウス作成に取り組み、実用にたるマウスを得ることに成功した。これにより生体内で、血液細胞のERK活性の時空間的動態変化をライブで観察できる系が立ち上がった。従来技術面で不能とされた解析が可能となった点が非常に意義深いと考える。
①Cre依存性レポーターマウス作成(ERKバイオセンサー)：ERKバイオセンサー遺伝子をROSA26 locousに相同組換えで遺伝子導入した。Cre-loxp systemを採用し組織特異的にERKバイオセンサーの発現が得られるよう工夫した。
②Creマウスの収集：組織特異的バイオセンサー発現のため交配相手となるCreマウスの収集を行い、CD8-Creマウス、LysM-Cre、Lck-Creマウスを入手した。
③発現確認：各系統のCreマウスと上記ROSA26_reporterマウスを交配し、組織特異的かつ従来のFRETマウスよりも高いバイオセンサー発現をFACS解析で確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上述の通り当初の研究計画からの変更を余儀なくされた。しかし、迅速に原因検索を行い克服すべく他の戦略に乗り換えた結果、目的とするトランスジェニックマウスを得ることが出来た。これにより本来目的としていた腫瘍関連マクロファージのみならず、腫瘍内に浸潤する細胞傷害性T細胞のイメージングも可能となり、将来的には双方同時観察・免疫制御機構のより詳細な解析が可能となることが期待される。迅速な方針転換とその成功を踏まえ、本研究課題の進捗状況はおおむね順調に進展していると評価する。
上記に加え、腫瘍微小環境可視化のモデルとして用いるマウスメラノーマの準備も順調に進んでいる。B16メラノーマ細胞株は古典的な系でありOVA発現細胞株など免疫応答制御解析に優れる系である。しかし、メラニンは強い自家蛍光を発し、生体内FRETイメージング時の解析の妨げとなり、これまでFRETイメージング解析には用いられてこなかった。そこで、CRISPR/Cas9 systemを用いてtyrosinaseをKOしメラニン産生をKOした細胞株の作出に取り組み、成功した。これにより、in vitro, in vivo双方で使用可能な細胞株が得られた。
上記2つの成果より、腫瘍微小環境可視化のための準備が整ったと言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
◆皮下担癌イメージング解析
皮下担癌腫瘍の系に用いるマウスメラノーマ細胞株の選定・作出には既に成功した。また、担癌のホストとなるトランスジェニックマウスの作出にも成功した。従って、今後は皮下担癌モデルにおける腫瘍微小環境イメージング解析に取り組む。
LysM-CreマウスとROSA26_reporterマウスを交配させたマウス（マクロファージ特異的にERKバイオセンサーを発現）に皮下イメージングウィンドウを設置し、ウィンドウ下に赤色蛍光タンパク質（Keima）を発現させた上記メラノーマ細胞株を担癌、イメージングを行う。プレナリーの結果として、腫瘍組織内に存在するマクロファージのERK活性にはheterogeneityが存在することが観察された。今後は、このERK活性のheterogeneityが局在や動態と相関するのか、各種免疫賦活化試薬に応答するのか、phenotypeとの相関があるのか、といった点に関して検討を加えていく予定としている。
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Research Products
(1 results)
