2016 Fiscal Year Annual Research Report
次世代型ゲノム編集技術ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いた低分子量タンパク質の機能解析
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16J09337
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
泰松 清人 山梨大学, 総合研究部, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | CRISPR/Cas9 / ゲノム編集 / ノックイン / ゼブラフィッシュ / 低分子量タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
既存の低分子量タンパク質データベースを利用し、機能ドメインの有無や進化的な保存性を考慮して、50種類を候補遺伝子として選別した。それらの遺伝子をクローニングし、胚発生期における発現を検出した。その結果から、胚発生期において造血・心血管を含む組織において特異的に高い発現が認められる低分子量タンパク質13種類を解析候補遺伝子として選別した。新年度においては、これらの標的遺伝子座位に対し、蛍光タンパク質遺伝子のノックインに取り組む予定である。
また、パイロット実験として行っていた低分子量タンパク質遺伝子ependymin related1 (epdr1) のノックインと機能解析については、ゲノム編集技術により標的座位がeGFP遺伝子にノックインされた系統を樹立した。この系統は、epdr1の発現がeGFP蛍光でモニタリングすることが可能であった。また、両アリルがノックインされた個体は脳神経形成の異常が観察された。すなわち、ゲノム編集技術によるノックインにより、標的遺伝子の発現可視化と、loss-of-functionの表現系の誘導が可能であることを示した。この研究成果はOta S *, Taimatsu K *, Yanagi K, Namiki T, Ohga R, Higashijima S, Kawahara A “Functional visualization and disruption of targeted genes using CRISPR/Cas9-mediated eGFP reporter integration in zebrafish” Scientific Reports, 6: 34991 (2016 October) *These authors contributed equally to this workとして発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
既存の低分子量タンパク質データベースを利用し、機能ドメインの有無や脊椎動物における進化的な保存度を考慮して、50種類を候補遺伝子として選別した。それらの遺伝子をクローニングし、whole mount in situ hybridization法によって胚発生期における発現を検出した。その結果から、胚発生期において造血・心血管を含む組織において特異的に高い発現が認められる低分子量タンパク質13種類を解析候補遺伝子として選別し、標的座位へのノックインのためのcrRNAを設計した。
また、パイロット実験として行っていた低分子量タンパク質遺伝子ependymin related1 (epdr1) のノックインと機能解析については、ゲノム編集技術により標的座位がeGFP遺伝子にノックインされた系統を樹立した。この系統は、epdr1の発現がeGFP蛍光でモニタリングすることが可能であった。さらに交配により、両アリルがノックインされた個体を得た。両アリルがノックインされた個体は中脳後脳境界におけるepdr1陽性の神経細胞の数が野生型と比較して減少していることが明らかとなった。すなわち、ゲノム編集技術によるノックインにより、標的遺伝子の発現可視化と、loss-of-functionの表現系の誘導が可能であることを示した。この研究成果は先述の通りScientific Reportsに発表した。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度において選定した候補遺伝子に対して設計したcrRNAのゲノム編集活性の評価を行う。活性の低いcrRNAについては、再設計し対応する。標的遺伝子のcrRNA、tracrRNA、Cas9タンパク質、レポーターベクターを1細胞期の胚にインジェクションし、F0個体を得る。
野生型とアウトクロスしたF1世代にて、標的座位にレポーターベクターがノックインされている個体を選定し、系統を樹立する。標的遺伝子の発現をeGFP蛍光がコピーしているかどうかを確認し、eGFP陽性細胞の挙動を観察する。さらにインクロスにより両アリルがノックインされた個体を作製し、表現型観察を行う。一見して表現型がないように見える場合でも、eGFP陽性細胞 (標的遺伝子陽性細胞) に着目して観察することで異常が検出される可能性がある。検出された異常に合わせて、細胞死の検出や細胞移動の精密なトレーシングなどを行い、標的遺伝子の機能を解明していく予定である。
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Research Products
(5 results)
