2016 Fiscal Year Annual Research Report
凝集体難病の克服に向けた小胞体マニピュレーション戦略
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16J09784
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
山下 ありさ 徳島大学, 大学院薬科学教育部, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | 小胞体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究が目指すのは、タンパク質凝集体難病の治療戦略の創出である。異常タンパク質凝集体の蓄積は、筋委縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、アルツハイマー病など多様な難治性筋肉疾患に共通する形態学的特徴であり、発症の要因とも考えられている。タンパク質凝集体難病の克服に向けて、本研究では筋肉難病クリスタリノパチーをモデル疾患に据えて小胞体微小環境コントロールに立脚した分子基盤の整備を目指す。我々の研究グループはキメラ分子小胞体型クリスタリンの有用性を細胞株で確認済みである(Yamashita et al., FEBS Lett., 2013; Yamamoto et al., Biochem Biophys Res Comm., 2014)。すなわち小胞体型クリスタリンの標的分子は治療標的分子として応用できる可能性が高い。そこで、平成２８年度はアフィニティ精製によって得られた「小胞体局在型クリスタリンの標的分子」の候補分子群をsiRNAでノックダウンし、クリスタリノパチーの発症原因の一つであるR120G変異体と小胞体局在型クリスタリンを共発現させタンパク質凝集体形成阻害能を評価した。その結果、小胞体タンパク質CLN6が小胞体局在型クリスタリンと共同で機能し凝集体形成抑制に関与していることを明らかにした。また、CLN6ノックダウン細胞にR120Gを単独で導入すると凝集体形成細胞の割合が上昇し、逆にCLN6を過剰発現させるとR120G凝集体形成が抑制された。さらに、免疫沈降の結果CLN6は小胞体局在型クリスタリンにもR120G変異体にも物理的相互作用を示した。以上の結果からCLN6単体でも凝集体形成抑制能を持つことを明らかにした。この凝集体形成抑制機構がタンパク質分解系に寄与しているか否かをLC-3のタンパク質量で評価した。その結果、分解系の機能亢進は認められなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は小胞体膜微小環境操作によるタンパク質凝集体難病治療戦略の創出を目指している。これは、小胞体局在型クリスタリンによる小胞体操作が異常タンパク質凝集体形成の蓄積に有用である、という我々の先の研究成果に基づいている。異常タンパク質凝集体の形成・蓄積は、糖尿病をはじめ様々な疾患でみられるが、それを抑制する方法はいまだ存在しない。凝集体形成・蓄積が疾患発症の原因か否かは未だに議論がなされている一方で、「凝集体の蓄積を抑制することにより疾患の治療が可能になるのではないか」と考えられている。すなわち、この分子機構を解明することによって凝集体難病の病態解明および治療法開発に貢献できる。平成２８年度の研究の結果、研究計画通りに小胞体微小環境をコントロールするための標的分子の一つとして小胞体膜タンパク質CLN6を同定することができた。一方でCLN6はリソソーム病の一つである神経セロイドリポフスチン症(vLINCL)の原因遺伝子であり、リソソームへの異常タンパク質凝集体の蓄積およびリソソームの機能異常を伴うことが報告されている。しかしながら小胞体タンパク質の変異によってなぜリソソームに機能異常が起こるのか、CLN6の実質的な機能は何か、依然として未解明である。今回の研究によってはじめてCLN6の機能の一端を明らかにすることができたと同時に、小胞体がリソソーム病であるvLINCLや凝集体難病の治療標的となりうる可能性が強く示唆された。さらに、他の標的分子の中にも凝集体形成への関与が認められた小胞体膜分子が数種類同定できている。すなわちこれらの分子がCLN6と同様にタンパク質凝集体難病治療の標的分子となる可能性が高いと考えられる。今後これらの分子の機能解析を通じて目標達成に努める。
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| Strategy for Future Research Activity |
①平成２８年度の研究結果からCLN6の抗凝集体形成能は小胞体局在型クリスタリンよりも低いということが明らかになった。このことから小胞体局在型クリスタリンの機能発現に関与している分子は複数存在すると考えられる。さらにCLN6以外にも小胞体局在型クリスタリンの機能発現に関与している可能性がある分子を同定しており、これらの分子も治療標的分子となる可能性が大いに期待できる。そこで平成２９年度は小胞体局在型クリスタリンの有用性を動物実験で確認する予定を変更し、候補分子の機能解析を細胞株レベルで行う。これまでの実験系にCRISPR/Cas9システムを用いた各分子のノックアウト細胞株の作出を追加し、これらを用いて凝集体形成への影響を評価する。
②分子メカニズムの解明および創薬シーズ創出には各分子の機能的領域を特定することが重要である。そのため現在各分子の欠失変異体発現ベクターを作出し、機能検証を進める。
③小胞体局在型クリスタリンもしくは「小胞体局在型クリスタリンの標的分子」の汎用性を検証する。タンパク質凝集体を形成する原因遺伝子は疾病ごとに異なる。ALSであればTDP-43、パーキンソン病であればα-シヌクレインが凝集体形成・蓄積を引き起こす代表例である。R120G変異体に対する効果を評価した際と同様に、それぞれの病原性タンパク質と小胞体局在型クリスタリンもしくは「標的分子」を細胞株内で共発現させ、凝集体形成・蓄積が阻害されるか否かを解析する。これまでに4種類の変異体発現ベクターを構築済みであるが、そのうち2種類ではHeLa細胞株での凝集体形成の観察が困難であった。これらの変異体については他の細胞株での実験を検討中である。凝集体形成が再現できたものについては、それぞれの実験条件の至適化を随時行う。条件が確定した変異体から順に小胞体型クリスタリンおよびCLN6等の汎用性について検証を行う。
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Research Products
(3 results)
