2016 Fiscal Year Annual Research Report
セントロメアタンパク質ＣＥＮＰ－Ｂのセントロメア構築における機能の解析
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16J10043
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
藤田 理紗 早稲田大学, 先進理工学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | セントロメア / CENP-A / CENP-B / ヌクレオソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、セントロメアタンパク質CENP-Bによるセントロメア特異的なクロマチン構造形成機構の解明である。セントロメアは正常な染色体分配に必須な染色体領域である。セントロメアが正常に機能するには、セントロメア特異的なヒストンバリアントCENP-Aを含むヌクレオソームを基盤とした、複数の因子から構成されるセントロメア特異的なクロマチン構造の形成が必要であると考えられている。これまでにCENP-BはCENP-Aヌクレオソームと直接相互作用することが報告されているが、その機能は明らかではない。本研究では、CENP-Bの機能の解明を目的とし、CENP-Bが誘起するセントロメア特異的なクロマチン構造を明らかにする。
平成28年度はX線結晶構造解析に向けて、複合体の調製方法の改良、および結晶化条件スクリーニングを行った。複合体の調製では、CENP-Bの精製方法の検討、ヌクレオソームに用いるDNAの配列の検討を行い、これまでよりもCENP-Bが安定してCENP-Aヌクレオソームに結合する複合体の調製系を確立した。そして、調製した複合体を用いて、結晶化条件のスクリーニングを行った。その結果、5つの結晶化条件において結晶の作製が可能となった。それらの結晶を用いてX線回折実験を行ったところ、10オングストロームの分解能の回折像を取得した。
また、X線結晶構造解析と並行して、CENP-B結合CENP-Aヌクレオソームのクライオ電子顕微鏡による観察を開始した。複数の方法を用いて複合体の解析を行うことで、構造解明に成功する可能性が向上すると考えている。
平成28年度の研究期間内において、ヌクレオソームの生化学的・構造生物学的解析を推進し、国内学会においてポスター発表3件を発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
CENP-Bが誘起するセントロメア構造の解明を目指し、CENP-BとCENP-Aヌクレオソームが結合した複合体のX線結晶構造解析に向けて、安定した複合体の調製方法を確立した。この複合体の調製方法によって、より品質の高い結晶を作成する事が可能になった。品質の高い結晶を用いることで、X線回折実験において高分解能の回折データの取得が期待できる。このようにして精製したCENP-BとCENP-Aヌクレオソームの複合体の結晶化条件のスクリーニングを行ったところ、複数の条件で結晶化に成功している。
加えて、X線結晶構造解析だけではなく、クライオ電子顕微鏡を用いた構造解析を開始した。既にクライオ電子顕微鏡観察により、CENP-Bが結合したCENP-Aヌクレオソームの観察像の取得に成功している。クライオ電子顕微鏡解析においては、X線結晶構造解析のように結晶化による構造の制約を受けていない立体構造解明が可能となる。現時点で、クライオ電子顕微鏡解析が可能なサンプル調製技術を確立したことは、来年度以降の構造解明に向けて貢献する成果であり、当初の計画以上に研究が進展したと考えている。
また、平成28年度の研究期間内において、これまでの研究成果について、国内学会ポスター発表3件を発表し、高い評価を得ている。以上のことから、本研究の成果は当初の想定を上回るものであり、本研究は当初の計画以上に進展していると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度では、CENP-B結合CENP-Aヌクレオソームの複合体調製系の確立および結晶化に成功した。それをふまえて、平成29年度以降はX線回折実験を行い、原子分解能での複合体の構造解析を目指す。具体的には、クライオプロテクタント溶液の組成や結晶の浸透時間を検討することで、回折像取得に適切な条件を決定する。
さらに、平成28年度より開始したクライオ電子顕微鏡解析を推進する。クライオ電子顕微鏡解析による観察は、X線結晶構造解析よりも巨大分子の構造解析に適している。生体内のセントロメアはCENP-Aヌクレオソームを基盤構造とした、多数のセントロメアタンパク質からなる巨大な複合体である。そこで、生体内の状態に近いセントロメア特異的なクロマチン構造を解明するために、構造形成に寄与する可能性があるセントロメアタンパク質を含むCENP-B結合CENP-Aヌクレオソームの複合体調製を試みる。それらの解析を通して、セントロメアクロマチン構造形成におけるCENP-Bの機能の解明を目指す。
また、セントロメアのクロマチンには、セントロメアタンパク質のみならず、セントロメア領域のDNA配列から転写されるノンコーディングRNAが集積することが報告されている。ノンコーディングRNAはCENP-Aと結合して、CENP-Aをセントロメアへリクルートする機能を有すると考えられている。そのような背景を受けて、平成29年度以降セントロメア特異的なクロマチン構造を解明するにあたって、ノンコーディングRNAのクロマチン構造への影響の解析に着手する。
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