2017 Fiscal Year Annual Research Report
セントロメアタンパク質ＣＥＮＰ－Ｂのセントロメア構築における機能の解析
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16J10043
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
藤田 理紗 早稲田大学, 理工学術院, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | CENP-B / CENP-Aヌクレオソーム / セントロメア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
セントロメアは染色体の均等分配に必要となるクロマチン領域である。セントロメアはCENP-Aヌクレオソームを基盤として、多数のセントロメアタンパク質から構成されている。セントロメアタンパク質CENP-Bは、認識DNA配列を含むCENP-Aヌクレオソームに結合することが報告されているものの、その機能の詳細は明らかでない。そこで、本研究ではCENP-Bのセントロメア構築における機能の解明を目的として、生化学的および構造生物学的解析を行っている。
本年度は、昨年度に引き続きCENP-B DNA結合ドメイン(CENP-B DBD: CENP-B DNA Binding Domain)とCENP-Aヌクレオソームの複合体のX線結晶構造解析に取り組んだ。昨年度に検討した結晶化条件で得られた複合体の結晶の回折実験を行い、高分解能の回折データを取得するためのクライオプロテクタント溶液の条件検討を行った。
さらに、CENP-B DBDとCENP-Aの相互作用機構の解明を目指し、CENP-B DBDとCENP-AのペプチドのX線結晶構造解析に取り組んだ。複合体の結晶を得るために、CENP-B DBDと認識DNA配列の複合体の結晶にソーキング法でCENP-Aペプチドを導入することを計画した。そこで、導入するCENP-Aペプチドのアミノ酸配列をプルダウン試験を用いて検討を行った結果、CENP-AのN末端領域がCENP-B DBDと相互作用することを明らかにした。
また、非コードRNAがセントロメア中のCENP-Aの保持に機能することが報告されている。そこで非コードRNAがクロマチン構造の形成や維持に寄与すると考え、特に非コードRNAがヌクレオソームに与える影響を生化学的に解析した。その結果、RNAがヌクレオソームの安定性の変化を引き起こすことを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究では、セントロメアにおけるCENP-Bの機能解明を目的とし、構造生物学的および生化学的な解析に取り組んでいる。本年度はCENP-B DBD結合CENP-AヌクレオソームのX線結晶構造解析と並行して、CENP-B DBDとCENP-Aの相互作用領域のX線結晶構造解析に向けて生化学解析による検討に着手した。そしてCENP-B DBDはCENP-AのN末端領域と結合することを明らかにした。したがって、セントロメアにおけるCENP-Bの機能解明に関する研究は順調である。それに加えて、セントロメアでのCENP-Bの機能に密接な関連が示唆されている非コードRNAに着目し、そのヌクレオソームへの影響についての生化学的解析に取り組んだ。そして、非コードRNA存在下では、ヌクレオソームの安定性が著しく低下するという発見を、世界に先駆けて見出した。この発見をきっかけに、非コードRNAのセントロメア形成における新規の機能を解明することが可能と考えている。
本年度の成果について、国内学会で口頭発表を2件、ポスター発表を1件、国際学会でポスター発表を2件行い、高い評価を得た。特に、新学術領域「生殖細胞エピゲノム」「ステムセルエイジング」「クロマチン動構造」3領域合同若手勉強会ではベストプレゼン賞を受賞した。以上より、本年度の成果は、当初の計画以上に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
セントロメアにおけるCENP-Bの機能解明に向けて、構造生物学的解析を推進する。CENP-Bの結合によって誘起されるセントロメア特異的なCENP-Aヌクレオソームの構造の解明を目指す。昨年度に引き続き、CENP-B DBD結合CENP-AヌクレオソームのX線結晶構造解析のため、結晶化条件のスクリーニングを行う。並行して、クライオ電子顕微鏡を用いて、この複合体の観察を行い、CENP-Bの結合がCENP-Aヌクレオソームの構造に影響を与えるのか明らかにする。それに加えて、本年度に見出した、非コードRNAがヌクレオソームの熱安定性を変化させる性質について、そのセントロメアクロマチンにおける役割を明らかにするために生化学解析、X線結晶構造解析およびクライオ電子顕微鏡解析に取り組む。これらの解析を通して、多数の因子から構成されるセントロメアのクロマチンの構築機構に新たな知見を得ることが期待できる。
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