2016 Fiscal Year Annual Research Report
マイクロドロップレットを用いた単一微生物からの生合成遺伝子クラスターの超並列解析
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16J10443
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
西川 洋平 早稲田大学, 先進理工学研究科, 特別研究員(DC1)
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2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | シングルセルゲノミクス / 全ゲノム増幅 / マイクロ流体デバイス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
環境中の微生物は99％以上が難培養性であり、生物界におけるダークマターと例えられる。難培養微生物が有する遺伝子の詳細な解析には、単一細胞レベルでのゲノム解析が有効であるが、従来までの手法では多様な細胞種に適用可能なスクリーニング量が得られていなかった。そこで本研究では、環境中の微生物がもつ全ゲノムの情報を単一細胞レベルで網羅的に解析し、標的となる有用遺伝子の情報を取得する技術の開発を目指す。
本年度は、単一細胞からの全ゲノム増幅反応に用いる微小液滴操作技術の開発を行った。開発したシステムは、(Ⅰ)液滴内への単一細胞の封入、(Ⅱ)2種の液滴の融合、(Ⅲ)液滴内での全ゲノム増幅反応の3段階からなる。分散媒中に含まれる界面活性剤の濃度およびデバイスの流路構造によって液滴の安定性を制御し、2種の液滴に対して毎秒200個の速度および95％の効率で融合を可能とするシステムを開発した。また、本システムにより単一細胞を封入した液滴と全ゲノム増幅試薬を含む液滴との融合を可能とし、ピコリットル容量の微小液滴内において、10,000個以上の単一細胞に対する超並列的な全ゲノム増幅を可能とした。
次に、モデル微生物を封入した微小液滴を作製し、液滴内部での溶菌効率および増幅後のDNA検出について条件の検討を行った。この結果、アルカリ溶液と加熱操作を組み合わせることで効率の高い溶菌が可能であることが明らかとなった。また、DNA結合性の蛍光色素を反応溶液に加えることにより、液滴内で増幅されたDNAを顕微鏡下で検出可能とした。さらに、蛍光の見られた液滴を分取し、二次増幅後に配列解析を行った結果、目的外のDNAに由来する増幅産物量が、従来法に比べて大幅に抑制されることが明らかとなった。これは、ピコリットル容量の微小空間を反応場として用いることにより、目的外DNAの混入リスクが低減された結果であると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り、初年度はマイクロ流体デバイスの設計およびモデル微生物を用いた実験条件の検討を行った。流速条件の最適化により、液滴内への単一細胞の封入、液滴の融合、液滴内での全ゲノム増幅反応の3つの工程をデバイス上で実現可能とした。これにより、10,000個以上の単一細胞に対して、超並列的な全ゲノム増幅を行うことが可能となった。封入した細胞に対する溶菌方法や全ゲノム増幅の反応時間など、詳細な反応条件についても検討を進めており、モデル微生物を用いた実験では、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両者を用いることにより、システムの有用性を示唆する結果が得られている。また、環境中の微生物を対象とした条件での検討を開始しており、次年度以降に必要とされる条件の検討をすでに開始している。増幅されたDNAの検出法として、現在ではDNA結合性の蛍光色素を使用しているが、今後は遺伝子特異的なDNA検出法の開発にも取り組む。研究全体の進捗としては、次年度以降に必要とされる検討をすでに始めていることから、当初の計画以上に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究実施計画に従い、開発したシステムを環境中の微生物を対象とした反応系へと応用する。海水または土壌中に含まれる微生物を対象としてゲノム解析を行うことにより、開発したシステムが多様な生物種が存在する環境サンプルを用いた場合においても有効であることを実証する。そのため、モデル微生物の場合に比べ、微生物画分の調製方法や液滴封入後の溶菌方法などについて、サンプルの特性に応じたプロトコルを作成する。また、ゲノム増幅時における標的遺伝子の検出機構についても併せて開発を進める。これにより、最終年度にむけて開発が必要とされる技術の基礎を確立する。
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