2016 Fiscal Year Annual Research Report
Ｂ型肝炎ウイルス感染の蛍光可視化モデルの樹立と肝炎免疫応答機構の探索
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16J11897
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| Research Institution | National Center for Global Health and Medicine |
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Principal Investigator |
犬塚 義 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, ゲノム医科学プロジェクト, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | 蛍光遺伝子 / HBV |
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| Outline of Annual Research Achievements |
下遠野研のNanoluc/HBV plasmidのNanolucを蛍光遺伝子に置き換えてまず蛍光遺伝子発現が確認されるか実験を始めた。蛍光遺伝子は輝度が最も高いものを2つ使用した（Azami-Green、Turbo-RFP）。Nanoluc直後のHBVのpreS1遺伝子領域のpromoterより上流の100bp程度を削り、蛍光遺伝子前後に制限酵素配列を付与して、PCR法とligationにより、蛍光遺伝子を挿入したHBV plasmidを2種類作成した（Azami-Green HBV, Turbo-RFP HBV）。HepG2細胞にそれぞれのplasmidを用いてtransfection(Lipofectamine 3000)したが、蛍光発色はなく、HBs抗原、HBe抗原のELISA測定法でHBVタンパクは検出されなかった。次に、In-Fusion HD cloning kitを用いて制限酵素配列のような、余分な配列を排除して蛍光遺伝子挿入を行い、新たに蛍光遺伝子挿入HBV plasmid（Azami-Green HBV, Turbo-RFP HBV）を作成した。HepG2細胞にそれらのplasmidをtransfection(Lipofectamine 3000)させると、Turbo-RFPでは20%程度の細胞に蛍光発色がみられたが、一方Azami-Greenではほんの3%以下程度の輝度の弱い蛍光発色しか確認されなかった。
次に、このTurbo-RFP挿入HBV(以下、RFP-HBV)を用いて感染実験を行った。HBVのε構造配列に変異を2か所挿入したHBV-⊿ε plasmidをHBVタンパクを補うため、co-transfectionさせた。14日間細胞培養し、7日間おきに上清を回収し、超遠心にて100倍濃縮して感染実験を行ったが、現状ではまだ粒子の形成は確認できていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
transfectionが成功したplasmidを作成できているため、理論上は粒子形成も望まれるが、HBVのカプシド内にHBV DNA(RT反応前のpregenomic RNA)が組み込まれるには、長さの調節がある程度必要な可能性がある。蛍光遺伝子は十分視覚的に確認できるため、あとは様々なplasmid長に振って感染実験を行っていくことが必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
Turbo-RFP挿入HBV(以下、RFP-HBV)を用いて感染実験を行ったが、現状ではまだ粒子の形成は確認できていない。なお、上清中のHBs抗原は確認されており、transfectionは問題なく行えていると考える。今後はHBV/NLをコントロールとして感染実験を進めていき、上記のように様々なplasmid長をふって感染が可能な蛍光HBVを作成したい。また、それが不可能であれば新しいツールである、minicircle technologyを用いて新たな蛍光遺伝子挿入HBV作成を模索したいと考えている。
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[Journal Article] Evolution of multi-drug resistant HCV clones from pre-existing resistant-associated variants during direct-acting antiviral therapy determined by third-generation sequencing.2017
Author(s)
Takeda H, Ueda Y, Inuzuka T, Yamashita Y, Osaki Y, Nasu A, Umeda M, Takemura R, Seno H, Sekine A, Marusawa H.
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 7
Pages: 45605
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] MSH2 Dysregulation Is Triggered by Proinflammatory Cytokine Stimulation and Is Associated with Liver Cancer Development.2016
Author(s)
Eso Y, Takai A, Matsumoto T, Inuzuka T, Horie T, Ono K, Uemoto S, Lee K, Edelmann W, Chiba T, Marusawa H.
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Journal Title
Cancer Research
Volume: 76
Pages: 4383-93
DOI
Peer Reviewed
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