2016 Fiscal Year Annual Research Report
マトリックス制御と部位特異的機能発現を実現する肝臓組織の生体外再構築
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16J40041
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
鵜頭 理恵 千葉大学, 大学院工学研究科, 特別研究員(RPD)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | 肝組織工学 / 肝細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，生体の肝臓内における肝細胞の機能発現を，生体外においてより忠実に再現できる3次元培養系の構築を目指し，そのための基盤技術を確立することを目的としている。将来的に新規薬剤代謝試験系や人工肝臓を開発するための基盤技術になりうると思われる。平成２８年度は，(1)新規微小I型コラーゲン粒子の作製とそれを用いた(2)複合型単位肝組織の作製，(3)複合型単位肝組織を導入するためのマイクロ流路の設計を行った。コラーゲンの線維化状態や科学的架橋の種類・有無などが肝細胞の機能やその維持に影響することが予想されることから，数種類の微小コラーゲン粒子を作製した。最初に，受入先のグループで開発された，マイクロ流路技術を用いた非平衡状態の液滴形成技術を応用することで微小I型コラーゲン粒子の作製し，数種の架橋剤を用いて架橋剤の検討を行った。また，上記の方法では，生体内で観察されるようなコラーゲン線維を有したコラーゲン粒子を作製することはできなかったために，別の方法でも微小コラーゲン粒子の作製を試みた。その結果，コラーゲン線維を有した様々な大きさのコラーゲン粒子を得ることも可能になった。
続いて上記で得られた微小コラーゲン粒子とヒト肝癌由来細胞株であるHepG2を様々な混合比で混ぜて，非接着性の培養皿に播種し，「複合型肝組織」を作製した。微小コラーゲン粒子と混合培養することで，適度に空隙をもった約100マイクロメートルの厚さの複合型肝組織を簡便に作製することが可能になった。さらに，「複合型肝組織」を導入し，3次元潅流培養を行うためのマイクロ流路の設計および作製を行った。来年度はラット肝細胞を用いて同様のことを行ない，機能評価を行う予定にしている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は，(1)新規微小I型コラーゲン粒子の作製 (2)HepG2を用いた複合型単位肝組織の作製，(3)複合型単位肝組織を導入するためのマイクロ流路の設計を行った。小動物実験室の立ち上げにトラブルがあり，当初予定していたラット初代肝細胞を使用することができなかったが，その他はおおむね当初の予定どおり実験を進めることができている。研究はおおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は，1年目に引き続き肝組織体の形成を行いつつ，まず，肝細胞機能の向上・維持を可能とするECM粒子のサイズ・種類・導入量などの至適条件の探索を行う。数多くの実験条件の中から肝細胞機能を上昇させる可能性がある条件を効率的に探索するために，主に遺伝子発現を定量的PCRによって評価する手法を導入する。当初の1年目の研究計画ではラットから分離した初代肝細胞を使用する予定だったが，小動物実験室の立ち上げに時間を要しており，ラット肝細胞の使用を断念し，ヒト肝癌由来細胞株HepG2を用いて実験を行った。平成29年度は動物実験を行う環境が整いつつあるので，ラット肝細胞を用いて組織作製・機能評価を行う予定にしている。
また，得られた組織体を初年度に設計したマイクロ流路内に集積化し，酸素濃度を制御した状態において潅流培養を行う。細胞機能に影響を与える重要なパラメーターとして，流速・初期酸素濃度・チャンバー形状・細胞導入量を変更しそれぞれ評価することで，部域特異性が実現するかどうか評価したい。
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