2017 Fiscal Year Annual Research Report
リポソームを用いたエキソソーム内ｍｉｃｒｏＲＮＡの高感度検出法の開発
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16J40215
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| Research Institution | Chuo University |
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Principal Investigator |
津金 麻実子 中央大学, 理工学部, 特別研究員(RPD)
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| Project Period (FY) |
2016-07-27 – 2020-03-31
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| Keywords | リポソーム / エキソソーム / RT-PCR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、前年度に成功したリポソーム内RT-PCR法における反応効率を詳細に検討した。合成mRNAを様々な濃度でリポソーム内に封入してRT-PCRし、RNAのRT-PCRによる増幅に由来する蛍光強度を検出した。その結果、RT-PCR効率はリポソームサイズによって異なること、直径5-10ミクロンのリポソーム内にRNAが10-100コピー内封されていれば検出可能であることが明らかとなった。これは前年度にヒトの細胞から抽出したtotal RNAを用いて検討した結果の妥当性を示すものであった。
次に、本研究の重要項目であるリポソームとエキソソームの融合について、まずは基礎的条件となるリポソーム同士の融合法の条件検討を行った。1年目に種々の融合法を試した結果、本年度はリポソームの凝集の影響がない電気融合法を選択した。リポソームとエキソソームの融合を模擬するため、一方のリポソームにはRT-PCRに必要な酵素、もう一方のリポソームにはRNAを内封したリポソームをそれぞれ調製し、これらを混合して電気融合した。リポソーム膜の染色やリポソーム内への蛍光色素の封入により融合を確認後、このリポソームをRT-PCRしたところ、蛍光顕微鏡によりリポソーム内でのRNAの増幅が検出できた。
加えて、本研究ではマイクロチャンバーを併用してアレイ化したシステムを志向している。そこでマイクロチャンバーに入れたリポソームをスライドグラス用のサーマルサイクラーでもRT-PCRにより検出できるか確認した。その結果、一部のリポソームでRNAの増幅を示す蛍光強度の増大が見られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度に確立したリポソーム作製条件をもとに、これまでの蛍光顕微鏡による検出だけではなく、フローサイトメーターを用いた解析によって、本システムにおけるリポソーム内テンプレートRNAの検出可能コピー数が明らかとなった。また、リポソームとエキソソームの融合を模擬した方法で両者の電気融合、その後のRT-PCRにより目的遺伝子の検出が可能であることが分かった。以上の結果から、エキソソーム内に目的のRNAが数十コピー存在し、エキソソームとリポソームの電気融合によってリポソーム内に直接取得できれば、RT-PCRによって検出可能であることが期待された。これらのデータをまとめて論文を執筆し、現在投稿中である。当初の研究計画になかった手法を積極的に取り入れながら、膜小胞の融合、リポソーム内でのRT-PCRによる検出と研究課題を着実に遂行しており、研究は順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでリポソーム同士の融合で得られた結果をもとに、今後はヒトの血漿から抽出したエキソソームの標準サンプルを入手し、脂質膜を蛍光染色してリポソームと膜融合させ、RT-PCRによる遺伝子増幅を行う。融合の効率をリポソームの脂質組成、融合方法などの種々の条件を変更して調査し、最適な条件を見出す。
また、今年度に検出システムのハイスループット化を目指して、マイクロチャンバーアレイにリポソームを配置しスライドグラス用のサーマルサイクラーでRT-PCRする方法に着手したが、反応効率が低かった。そこで今後はチャンバーのデザインを工夫するなどデバイスの改善を試みる。
加えて、これまでは検出対象をエキソソーム内の存在比が高いrRNAやmRNAとして検出条件の確立を行ったが、本年度はmicroRNAの検出を検討する。
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Research Products
(7 results)
