2017 Fiscal Year Annual Research Report
ミクログリアを介した機能的神経回路形成の分子基盤の解明
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16J40220
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
佐柳 友規 東北大学, 生命科学研究科, 特別研究員(RPD) (00527012)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | ミクログリア / マーモセット |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに、各発達段階のマーモセット大脳皮質を用いた網羅的遺伝子発現解析により、スパイン刈り込み制御に関与する候補分子として軸索誘導因子、ミクログリア関連分子などを見いだしている。前年度は、これまでに確立されていないマーモセット由来初代培養ミクログリアの調製法の確立を計画し、初代培養ミクログリアは齧歯類（マウス及びラット）からの調製法はすでに確立されているため、その手法を踏襲する予定であった。しかし、この手法では得られるミクログリアは新生児由来のものに限られる。また、生後直後のマーモセット脳内におけるミクログリアを観察したところ、齧歯類における生後直後のミクログリア形態とは大きくかけ離れていることが明らかになり、出生時にマーモセットは齧歯類よりも脳発達が進んでいることが推測された。さらに、これまでの検討から発達段階におけるミクログリアを用いた検討も行う必要が生じたため、磁気ビーズを用いた細胞単離法を検討した。平成29年度は検討を重ね、磁気ビーズ法によるマーモセットからのミクログリアの単離方法を確立した。現在は、生後直後、生後2ヶ月齢、3ヶ月齢、6ヶ月齢の各発達段階におけるマーモセットからミクログリアの単離が完了した段階である。ミクログリア取得方法については当初の予定を変更することになったが、この手法で取得された細胞を用いて発達過程における各種遺伝子の発現変動を解析する予定である。
平成29年度は、ミクログリアの機能に関与する分子として、貪食マーカーとして知られるCD68、増殖マーカーであるKi67、炎症性サイトカインのIL-1β、TNFα、MCP-1、M2タイプミクログリアマーカーであるCD206、IL-10などがマーモセットサンプルでも染色可能であることを確認し、本年度は実際の各発達段階におけるマーモセット脳切片を用いて免疫染色を実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
げっ歯類で確立されている初代培養ミクログリアを用いて、遺伝子発現変化の解析を実施する予定であったが、生後直後のマーモセット脳内におけるミクログリアの形態は齧歯類における生後直後のミクログリア形態とは大きくかけ離れていることが明らかになり、げっ歯類と同様の手法ではミクログリアの取得が困難であると考えられた。また、生後直後のみならず、各発達過程におけるミクログリアも取得する必要が生じたため、予定していた初代培養法ではなく、磁気ビーズを用いた細胞単離法を新しく確立することに予定を変更した。新しい技術の習得に時間を要し若干の遅れは生じたものの、順調に技術を習得することができ、免疫組織化学的手法により取得された細胞が目的のミクログリアであること、機能評価によりミクログリアが貪食能を有していることを確認できた。生後直後、生後2ヶ月齢、3ヶ月齢、6ヶ月齢の各発達段階におけるマーモセットからミクログリアの単離を完了し、今後は各種遺伝子発現変動を検討する予定である。
また、ミクログリアの機能に関与する分子として、貪食マーカーとして知られるCD68、増殖マーカーであるKi67、炎症性サイトカインのIL-1β、TNFα、MCP-1、M2タイプミクログリアマーカーであるCD206、IL-10などがマーモセットサンプルでも染色可能であることを確認し、本年度は実際の各発達段階におけるマーモセット脳切片を用いて免疫染色を実施した。
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| Strategy for Future Research Activity |
ミクログリア取得方法を当初の初代培養法から変更し、新しく磁気ビーズ法を用いた方法を確立できたため、この方法で各発達段階（生後直後、生後2ヶ月齢、生後3ヶ月齢、生後6ヶ月齢）のマーモセット脳からミクログリアを取得し、網羅的遺伝子発現解析を実施する。また、マーモセットを灌流固定し、摘出された脳から脳切片を作製し、ミクログリア機能関連分子の発現変化について免疫組織化学的手法で解析する。CD68、Ki67、IL-1β、TNFα、MCP-1、CD206、IL-10などに対する抗体を用いて染色し、各発達段階における発現変動を比較解析する。
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