2018 Fiscal Year Annual Research Report
ＤＮＡポリメラーゼηとＲＡＤ１８が関与する新たなチェックポイント機構の解析
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16J40244
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
松尾(楠本) 理加 名古屋大学, 環境医学研究所, 特別研究員(RPD)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2020-03-31
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| Keywords | DNAポリメラーゼ / Rad18 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
PolηのC末端領域がRad18のC末端領域と結合することが報告されている。PolηのN末端領域（1-511aa）もRad18と結合することを見出し、その意義を明らかにするために研究を進めている。
Polη（1-511aa）と相互作用するRad18の領域を同定するため、Rad18のC末端欠失変異体を作製し、結合実験を行った。その結果、Rad18のC末端が、Polη（1-511aa）と結合することが明らかとなった。
Polη（1-511aa）にはDNAポリメラーゼドメインと２つのPCNA結合領域、そして機構は不明である結晶構造上ループアウトした領域を含む。これまでの結果は、ループアウトした領域がRad18と結合することを示唆していた。報告されている結晶構造より、Rad18と直接結合しそうなループアウト内の３アミノ酸を推測し、これらのアミノ酸を全てアラニンに置換した組換えPolη（1-511aa）AAA変異体を作製した。AAA変異体はRad18との結合が60%に減少した。また、AAA変異体はPolη欠損細胞の紫外線感受性を一部しか相補できないことを示した。
ループアウト領域にHisまたはGSTタグを融合して発現させたタンパク質を作製し、５種類のRad18結合実験を行ったが、そのうち結合を示したのは１種類の実験だけあった。
ループアウトした部分はPolη（1-511aa）とRad18との結合に補助的に機能すると考え、ループアウトした領域以外でRad18との結合領域の探索を試みた。Polη（1-511aa）をさらに断片化した欠失変異体を作製し、Rad18との結合実験を行ったが結合領域を絞ることはできなかった。これはポリメラーゼドメインを断片化することとなり、本来のPolηの構造を保つことができなくなったことが原因であるのかもしれない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
結合実験の結果が予想と異なるものであり、再度結合領域を調べているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
酵母ツーハイブリッド試験によりPolη（1-511aa）内のRad18結合領域を調べる。PCRを用いてランダムミューテーションをPolη（1-511aa）に導入し、スクリーニングを行い、Rad18C末端との結合に関与しない領域を明らかにする。
GST-Polη(1-511)の野生型及び変異体[AAA]と、UV照射した細胞より作製した抽出液を用いてGSTプルダウンアッセイを行う。野生型がUV照射により特異的に結合するタンパク質を質量分析により同定する。同定したタンパク質との結合がUV照射後どのような時間で起こるのかを調べる。同定したタンパク質の既知の機能に応じて分子機構を推測し、機能に応じた実験を行う。
Polη[AAA]安定発現細胞のUV照射後の細胞周期の進行や、主要なチェックポイント関連因子の活性化状態を検討する。
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Research Products
(2 results)
