2018 Fiscal Year Research-status Report

ＤＮＡ損傷を負った細胞が生死の運命を決定する時期と要因の解明

Research Project

Project/Area Number	16K00549
Research Institution	Kanazawa Medical University
Principal Investigator	橋本光正金沢医科大学, 一般教育機構, 准教授 (70293975)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	奥田光一金沢医科大学, 一般教育機構, 講師 (60639938)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2020-03-31
Keywords	細胞周期チェックポイント / ミトコンドリア膜電位 / 細胞分裂 / DNA合成 / 核膜構造
Outline of Annual Research Achievements	DNA損傷を負った細胞は、損傷を修復して生存を試みるのか、修復をあきらめてアポトーシス死へ舵を切るのか、この運命の決定をいつ、どのように下すのであろうか。本研究では、X線照射後の細胞をタイムラプスレーザー共焦点顕微鏡で動画撮影し、最終的に生存あるいはアポトーシス死に移行した細胞の照射以降の状態を、時間をさかのぼって観察した。本研究は、DNA損傷部位に集積する53BP1のフォーカスの数、形態、容積を指標に、運命の決定を下す時期と運命を決定づける要因(DNA損傷数なのか、損傷の質なのか、損傷を受けた細胞周期なのかなど)を明らかにすることを目的としている。前年度までの研究結果より、私たちは、72～96時間の範囲が細胞の修復完了かアポトーシス死かの分枝点であることを見出した。そこでこの範囲に着目して、アポトーシス志向細胞について調べたところ、(1)DNA損傷が増加すること、(2)残存ATMの脱リン酸化が起こること、(3)ミトコンドリア膜電位が不安定化すること、(4)核膜構造が脆弱化すること、を見出した。次に生存志向細胞について調べたところ、(1)細胞周期チェックポイント機構が強く機能し、G2期停止時間が長いこと、(2)G1期停止時間には依存しないこと、（S期停止時間については検討中）(3)ミトコンドリア膜電位が高い値で安定化した後、96時間を目処に急激に低下すること、を見出した。 BrdUの取り込みで調べたところ、24～72時間の範囲でBrdUの取り込みが多い細胞は、上述したアポトーシス志向細胞の特徴を見いだすことができた。BrdUの取り込みが少ない細胞は、その逆に生存志向細胞の特徴を見いだすことができた。 DNA修復タンパクATM、53BP1の免疫染色の結果、72～96時間の範囲で残存するフォーカスは24時間以内にある様なフォーカスと異なり、大きくなる傾向があった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 1. 使い慣れたフローサイトメトリー（ベクトンデッキンソン）が故障のため、学内の別のフローサイトメトリーを使用することになった。条件設定などをやり直す必要がある。 2. 動画解析に使用していたコンピューターが作動不良のため、入れ替えた。解析ソフトの再設定などを行なっている。
Strategy for Future Research Activity	動画120以降の解析を行う。今まで動画120以前の解析を中心に行ってきた。今後は動画120以降の解析も行い、今までと同様のこと、A. Fastアポトーシス、Slowアポトーシスのp53依存性を確かめる。siRNAでp53発現を抑制したU2OS-E53BP1-FG1細胞株にX線照射を行う。p53の発現抑制によりFastアポトーシス数は減少するが、Slowアポトーシス数およびコロニー形成率は変化しないことを確認する。B. Fastアポトーシスを決定付けるDSBの状態、細胞周期を明らかにする。U2OS-E53BP1-FG1細胞株にX線照射を行う。動画-96の解析で、照射を受けた細胞周期や、53BP1のフォーカス数、大きさ、形、消失速度を指標に、照射後DSBがどのように変化するとFastアポトーシスに進行するのかを明らかにする。C. Slowアポトーシスへの進行を決定付けるDSBの状態、細胞周期を明らかにする。 U2OS-E53BP1-FG1細胞株にX線照射を行い、動画-192でSlowアポトーシスに陥った細胞について、細胞周期や照射後のDSBの変化を調べる。これによりSlowアポトーシスを引き起こす要因を明らかにする。D.生存細胞、Fastアポトーシス死細胞とSlowアポトーシス死細胞について、DNA修復機構(NHEJ、HR)との関係を明らかにする。U2OSにRad54、Rad51、Ku70、Ku80、DNA-PKcs各遺伝子のsiRNAを処理し、HR、NHEJを抑制する。HR、NHEJを個別に、あるいは両方とも抑制した細胞について上記A~Cと同様のことを調べる。それぞれのDNA修復が個別に、あるいは両方とも抑制されたとき、(i)Fastアポトーシス死と(ii)Slowアポトーシス死のいずれかが促進されるか、両方が促進されるかを明らかにする。
Causes of Carryover	予算計上時より、一部の物品において、キャンペーン特価で安価で購入することができたため次年度使用額が生じた。フローサイトメトリー（ベクトンデッキンソン）が故障のため、計画が遅れている。次年度使用学は、本学内にある他のフローサイトメトリーを使用するための試薬購入に使用する予定である。