2016 Fiscal Year Research-status Report

難修復性DNA損傷の細胞内可視化を目的とした光物理化学研究

Research Project

Project/Area Number	16K00551
Research Institution	National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology
Principal Investigator	赤松憲国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 関西光科学研究所量子生命科学研究部, 上席研究員(定常) (70360401)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2020-03-31
Keywords	DNA損傷 / 蛍光異方性 / Alexa488 / 重粒子線 / クラスターDNA損傷 / ホモFRET
Outline of Annual Research Achievements	高LET(線エネルギー付与)放射線の飛跡周辺や二次電子の飛跡末端で生じやすいとされているクラスター損傷（複数の損傷がＤＮＡ上の狭い領域に集中的に生じている）は修復が困難とされているが、その化学構造、線質・エネルギーの違いとの関係についてはほとんど明らかにされていない。我々はこのような損傷の実体を解明するために、2つの蛍光分子間で起こる蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を利用したDNA損傷局在性評価法の開発を行ってきた。すでに、蛍光分子ペアとしてAlexa350及びAlexa488を用いた結果（ヘテロFRET）、炭素線のトラック1本で脱塩基部位（AP）クラスターが一気に生じることを明らかにしている（Radiat.Res.2015）。しかしながら、ヘテロFRETによるプロトコルは、その簡便性や検出感度が十分でなく改善策が必要であった。そこで同一種類の蛍光分子間でのFRET（ホモFRET）を観察することによって損傷局在性を調べる方法を新たに考案した。なお、ホモFRETの大きさは、ヘテロFRETのように蛍光の減衰率から直接求めることができないので、別の指標：蛍光異方性に着目した。 28年度の実験内容及び結果を以下に示す。（１）ＤＮＡ損傷の局在性を蛍光異方性で評価できるかどうかを確かめるために、損傷間距離既知のモデルＤＮＡに蛍光標識（Alexa488）し、蛍光異方性と損傷間距離の関係を調べた。その結果、損傷間距離の増加に従って蛍光異方性が減少することを確認した。（２）損傷（AP）をランダムにもつＤＮＡを熱処理によって作成し蛍光異方性を調べた。損傷がランダムな場合の理論曲線と比較した結果、極めて良い一致が見られた。（３）ブラッグピーク付近の炭素線を乾燥ＤＮＡに照射し、蛍光異方性を測ったところ、飛跡一本でクラスター損傷ができることを確認した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason (1)蛍光異方性がホモFRETによって減少することを利用した、クラスターDNA損傷解析法の開発に成功した。 (2)27年度までに行っていた、ヘテロFRETによる解析方法の結果と一致することを確認した。検出感度、実験プロトコルの簡便化にも成功した。
Strategy for Future Research Activity	(1)種々の放射線・化学物質を用いて、開発した蛍光異方性による方法によりクラスターDNA損傷の形態を網羅的に調べる (2)AP以外の損傷への適用方法を開発する (3)クラスターＤＮＡ損傷の細胞核内可視化方法を開発する
Causes of Carryover	(1)照射実験のための出張が予定より少なかった (2)蛍光試薬・プラスミドDNAの数量が予定より少なかった
Expenditure Plan for Carryover Budget	(1)照射実験の出張：300千円、(2)国内学会出張：100千円、(3)プラスミドDNA：300千円、(4)蛍光試薬：400千円、(5)DNAオリゴマー：200千円、合計：1300千円