2017 Fiscal Year Research-status Report
難修復性DNA損傷の細胞内可視化を目的とした光物理化学研究
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16K00551
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| Research Institution | National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology |
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Principal Investigator |
赤松 憲 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 関西光科学研究所 量子生命科学研究部, グループリーダー(定常) (70360401)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | DNA損傷 / 蛍光異方性 / Alexa488 / 重粒子線 / クラスタ―ＤＮＡ損傷 / ホモFRET / 塩基欠損部位 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高LET放射線の飛跡周辺や二次電子の飛跡末端で生じやすいとされているクラスター損傷（複数の損傷がＤＮＡ上の狭い領域に集中的に生じている）は修復が困難とされているが、その化学構造、線質・エネルギーの違いとの関係についてはほとんど明らかにされていない。我々はこのような損傷の実体を実験的に解明するために、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を利用したDNA損傷局在性評価法の開発を行ってきた。前年度までに我々は、同一種類の蛍光分子間でのFRET（ホモFRET）から損傷局在性の評価が可能であることを示してきた。なおホモFRETの大きさは、蛍光異方性（fluorescence anisotropy）を観察することによって行った。また、検出対象の損傷は、塩基欠損部位などのアルデヒド／ケトン型損傷（AP等）とした。
DNA損傷因子には各種放射線、及び放射線様作用をもつ化学物質、MMS（methylmethanesulfonate）、及びNCS（neocarzinostatin）を用いた。照射用のDNA試料にはpUC19の乾燥薄膜あるいは水溶液を用いた。各種DNA損傷因子で処理したDNA試料のAP等に、蛍光標識剤AlexaFluor488を結合させた。蛍光異方性測定は80 wt％グリセリン／10mM TE中、10℃で行った。その結果、放射線と化学物質では、クラスター損傷の生じ方に塩基配列に起因すると考えられる相違があることが明らかとなった。また放射線の線質間の比較のために、低LET標準線源としてコバルト60ガンマ線、高LET線源としてHe、C、Feイオンビームを用いた。クラスター損傷の生じ方の違いは、DNA試料に乾燥薄膜を用いた場合に顕著に表れたが、細胞核内模擬条件下（～10g/L in 0.2M Tris buffer）では、乾燥DNAの場合ほど明確な相違は認められなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1)蛍光異方性によってＤＮＡ損傷（塩基欠損部位ＡＰ）の局在性を評価することに成功した。その方法論、及びCo-60ガンマ線、ＤＮＡ損傷性化学物質の場合の結果を論文にまとめた（Analytical Biochemistry 536(2017)78-89）。
(2) (1)で開発した方法を用いて、様々な粒子線（ヘリウム、炭素、鉄）によるＤＮＡ損傷の局在性を評価した（乾燥状態、及び細胞模擬条件下にて照射実験）。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)データが概ね出そろったので、放射線によるDNA損傷局在性に関する成果を論文にまとめる。
(2)AP以外の損傷への適用方法を開発する。
(3)局在したＤＮＡ損傷の細胞核内可視化方法を開発する。
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| Causes of Carryover |
＜理由＞
(1)照射実験のための出張が予定より少なかった。(2)蛍光試薬・ＤＮＡ等の消耗品が購入数量が予定より少なかった。
＜使用計画＞
(1)照射実験の出張：300千円、(2)国内学会出張：100千円、(3)DNA、蛍光試薬：800千円、(4)DNAオリゴマー外注合成：300千円、(5)照射用ホルダーの製作：500千円（合計：2000千円）
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