2016 Fiscal Year Research-status Report
クラスターDNA損傷が誘発するDSB末端のKuタンパク質による認識機構の解明
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16K00554
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
藤本 浩文 国立感染症研究所, 品質保証・管理部, 主任研究官 (60373396)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小池 学 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 放射線医学総合研究所 分子イメージング診断治療研究部, 主幹研究員(定常) (70280740)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | クラスターDNA損傷 / DNA修復 / Ku |
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| Outline of Annual Research Achievements |
電離放射線によるDNA損傷には放射線の飛跡に沿って損傷が集中しやすい特徴があると考えられ、クラスターDNA損傷と呼ばれる。単独の損傷の場合と比べるとクラスターDNA損傷は修復酵素が作用しにくいために修復されにくく、また、複数の損傷が近傍に存在することから二本鎖切断（double strand break: DSB）を誘発しやすいと考えられる。KuはDSB末端を認識し、これに結合するタンパク質であり、Kuタンパク質の結合を足がかりとしてDSB修復経路の一つであるnon-homologous end-joining（NHEJ）が開始されると考えられている。NHEJにおけるKuタンパク質結合後の修復プロセスは生化学的、分子細胞生物学的実験により詳細な報告がなされているが、その最も初期の過程であるKuタンパク質によるDSB末端認識結合機構には未だ不明な点が多い。クラスターDNA損傷が誘導するDSB末端は一本鎖の突出、末端近傍塩基の損傷等、DNA切断時の状況よって様々なバリエーションが考えられる。本研究では、クラスターDNA損傷によって誘発されるDSBをKuタンパク質がどのように認識し結合するのかを、従来の分子細胞生物学的手法に加え計算化学的手法を導入することで明らかにしたい。
本年度は、クラスターDNA損傷が生じた場合に想定される二本鎖切断末端構造として、5'突出末端、および酸化損傷塩基を配置したDNA分子モデルを作成し、分子構造の変化を分子シミュレーションにより観察した。また、ライブセルイメージング法を用いて細胞内におけるKuタンパク質の挙動を検証するためのモデルとして、マウス、ヒトに続きイヌのKuタンパク質の挙動を追跡する実験系を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、クラスターDNA損傷が生じた場合に想定される二本鎖切断末端構造の例として、5'突出末端一本鎖上、もしくは二本鎖領域に損傷塩基を配置したDNA分子のモデリングを行った。これまでモデリングを行って来たSSB、8oxoG等の力場パラメーターを利用し、5'側に1塩基～5塩基突出したDNA末端を設計し、二本鎖領域中に8oxoGを配したDNAモデルを作成した。各分子モデルに対し数ナノ秒間MDシミュレーションを行い、末端が平滑なDNAの計算結果と比較すると、突出末端側二本鎖領域中の塩基対が解離する等、やや不安定な挙動を示すものの明瞭な分子構造の崩壊は観察されなかった。
また、挿入する酸化損傷塩基にはこれまでモデリングを行ってきた酸化損傷プリンである8oxoGを用いてきたが、酸化損傷ピリミジンの例としてthymineglycolを含むDNA分子のモデリングも検討した。現在、分子軌道計算ソフトウエアGAUSSIANを用いた計算によって得られた電子状態を反映させた力場パラメーターを作成中である。
更に、ライブセルイメージング法を用いて細胞内におけるKuタンパク質の挙動を検証するためのモデルとして、マウス、ヒトに続きイヌのKuタンパク質の挙動を追跡する実験系を確立し、マイクロビーム照射により誘発されたDSBにKuタンパク質が凝集される様子を観察した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引続きクラスターDNA損傷が生じた場合に想定される二本鎖切断末端構造を含むDNA分子のモデリング作業を行う。また、検証が終ったDNA分子から順次Kuタンパク質を作用させた複合体モデルを作成し、数ナノ秒レベルのMDシミュレーションを行う。計算結果からKu-DNA間の結合エネルギーを推定し、平滑末端を持つDNA分子とKuタンパク質との結合エネルギーと比較する事で、DNAの末端形状がKuタンパク質との結合力に与える影響の評価を行う。
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| Causes of Carryover |
本年度、研究代表者は既存の設備を用いて研究を実施し、また学会発表は行わず、研究打合せ等にも所属機関で行ったため、物品費、旅費等の支出が当初の計画より少なくなり次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
既存のクラスターマシンを制御するワークステーションが経年劣化により徐々に期待される性能を発揮できなくなってきているため、次年度使用額と交付額の一部を使用して機器の補修、もしくは必要に応じて更新を行う予定である。
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