2017 Fiscal Year Research-status Report
クラスターDNA損傷が誘発するDSB末端のKuタンパク質による認識機構の解明
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16K00554
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
藤本 浩文 国立感染症研究所, 品質保証・管理部, 室長 (60373396)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小池 学 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 放射線医学総合研究所 重粒子線治療研究部, 主幹研究員(定常) (70280740)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | クラスターDNA損傷 / DNA修復 / Ku |
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| Outline of Annual Research Achievements |
電離放射線によるDNA損傷には放射線の飛跡に沿って損傷が集中しやすい特徴があると考えられ、クラスターDNA損傷と呼ばれる。単独の損傷の場合と比べるとクラスターDNA損傷は修復酵素が作用しにくいために修復されにくく、また、複数の損傷が近傍に存在することから二本鎖切断（double strand break: DSB）を誘発しやすいと考えられる。KuはDSB末端を認識し、これに結合するタンパク質であり、Kuタンパク質の結合を足がかりとしてDSB修復経路の一つであるnon-homologous end-joining（NHEJ）が開始されると考えられている。NHEJにおけるKuタンパク質結合後の修復プロセスは生化学的、分子細胞生物学的実験により詳細な報告がなされているが、その最も初期の過程であるKuタンパク質によるDSB末端認識結合機構には未だ不明な点が多い。クラスターDNA損傷が誘導するDSB末端は一本鎖の突出、末端近傍塩基の損傷等、DNA切断時の状況よって様々なバリエーションが考えられる。本研究では、クラスターDNA損傷によって誘発されるDSBをKuタンパク質がどのように認識し結合するのかを、従来の分子細胞生物学的手法に加え計算化学的手法を導入することで明らかにしたい。
本年度は、クラスターDNA損傷が生じた場合に想定される二本鎖切断末端構造モデルとして、主にThymine glycol (TG) を含むDNA分子のモデリングを行い、Ku-DNA間の結合力を推定した。計算結果の妥当性を検証するため、現在計算に用いたTGを含むDNA配列を合成し、ゲルシフト・アッセイを行なっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度に引続き、クラスターDNA損傷が生じた場合に想定される二本鎖切断末端構造モデルの構築を行なった。本年度は挿入する酸化損傷塩基としてThymine glycol (TG) を含むDNA分子のモデリングを行った。TGには２種類の光学異性体、TG (5R, 6S)，TG (5S, 6R)が存在する事が報告されている。そこで、両異性体の分子構造に対して分子軌道計算を行い、得られた電子状態を反映させた力場パラメーターを作成、既報のKu-DNA複合体モデル中のThymineと置換した分子モデルを作成した。非損傷DNAとKuとの複合体モデルも加え、３種類の分子モデルに対して、それぞれ３ナノ秒間の分子動力学計算を行い、得られた座標データからKu-DNA間の結合力を推定したところ、非損傷DNA-Ku > TG (5S, 6R)を含むDNA-Ku > TG (5R, 6S)を含むDNA-Kuの順で両分子間の結合力が減少する事が判明した。現在、計算結果の妥当性を検証するため、計算に用いたTGを含むDNA配列を実際に合成し、Kuを作用させてゲルシフト・アッセイを行なっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
引続きクラスターDNA損傷が生じた場合に想定される二本鎖切断末端構造を含むDNA分子のモデリング作業を行う。一昨年度、明らかな分子構造の差異が観察されなかった5'突出末端一本鎖上、もしくは二本鎖領域にSSB、および8oxoGを配置したDNA分子に関しては、突出塩基数、および損傷塩基の位置を変え再度モデリングを行っている。また、TGを含むDNA分子においても、TGの配置を変えてモデリングを行なう。検証が終ったDNA分子から順次Kuタンパク質を作用させた複合体モデルを作成し、MDシミュレーションを行う。計算結果からKu-DNA間の結合エネルギーを推定し、平滑末端を持つDNA分子とKuタンパク質との結合エネルギーと比較する事で、DNAの末端形状がKuタンパク質との結合力に与える影響の評価を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度予定していたクラスターマシンを制御するワークステーションの補修、機能更新を次年度に見送った分、次年度使用額が生じた。
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