2017 Fiscal Year Research-status Report
核内受容体を介した有機リン系難燃剤の免疫毒性作用に関する研究
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16K00558
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| Research Institution | Gifu Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
井戸 章子 岐阜薬科大学, 薬学部, 助教 (00336629)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
永瀬 久光 岐阜薬科大学, 薬学部, 教授 (40141395)
中西 剛 岐阜薬科大学, 薬学部, 准教授 (50303988)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 有機リン系難燃剤 / PPARγ / RXRα / 核内受容体アゴニスト活性 / 樹状細胞 / DC2.4細胞 / 細胞毒性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
最近よく使用されている有機リン系難燃剤は空気中に徐々に揮発することから、慢性的な経肺曝露による気道炎症や、経皮曝露による皮膚疾患などが懸念される。シックハウス症候群や化学物質過敏症との関連も疑われているが、科学的データはほとんど報告されていない。一方で申請者らは、一部の有機リン化合物がPPARγアゴニスト活性を持つことを見出した。PPARγは、免疫系において炎症反応の進展や免疫機構に関与していることが明らかとなっている。本研究では、有機リン系難燃剤の核内受容体を介した免疫機能への関与を明らかにする。平成28年度は、有機リン化合物であるTriphenylphosphine oxideが、hRXRαおよびPPARγのアゴニスト活性を示すことを見出した。また、有機リン系難燃剤の獲得免疫に対する影響を検討するために、マウス由来樹状細胞株（DC2.4細胞）とモデル抗原として卵白アルブミン（OVA）を用い、被験物質が抗原提示能に及ぼす影響を評価する系を立ち上げている。
平成29年度は、実際に使用されている6種類の有機リン系難燃剤について、DC2.4細胞へ与える毒性を[3H]-Thymidine取り込み試験により評価し、上記試験系で用いる各化合物の濃度を決定した。さらに、DC2.4移植実験によるマウス生体内での獲得免疫への影響を評価するために、獲得免疫応答の最終産物である抗体産生量に対する各種有機リン系難燃剤の影響についての評価系を立ち上げた。抗原としてOVA で刺激したDC2.4細胞を野生型マウスに移植免疫後、血清中のOVA特異的IgG抗体量をELISA 法により確認したところ、移植前の血清と比較して優位な上昇が確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29年度は、被験物質が抗原提示細胞への分化や抗原提示能に及ぼす影響を評価するための予備実験として、実際に使用されている6種類の有機リン系難燃剤について、DC2.4細胞へ与える毒性を[3H]-Thymidine取り込み試験により評価した。Cresyl Diphenyl Phosphate（CDPP)、2-Ethylhexyl Diphenyl Phosphate（EHDPP)、Tricresyl Phosphate（TCP)、Tris(1,3-dichloro-2-propyl) Phosphate（TDCIPP)においては10μg/mLから、Triphenyl Phosphate（TPhP)では100μg/mLから、Tris(2-chloroethyl) Phosphate（TCEP)では1000μg/mLから細胞死が見られた。よって今後の実験は、各難燃剤についてこれらの濃度を上限として行うこととした。
また、DC2.4 移植実験によるマウス生体内での獲得免疫機能への影響を評価するために、獲得免疫応答の最終産物である抗体産生量に対する各種有機リン系難燃剤の影響についての評価系を立ち上げた。抗原としてOVA で刺激したDC2.4細胞を増殖できないようにマイトマイシン処理し、野生型マウスに1週間おきに２回移植免疫を行った。さらにその１週間後に採血し血清中の抗原特異的IgG抗体量をELISA 法により測定したところ、コントロールと比較して優位に上昇していた。よって、本予備実験により、移植実験の条件が決定した。
実際に有機リン系難燃剤を用いた評価は完了していないが、これでDC2.4細胞を用いた今後の実験のプロトコールが決定し、実験をスムーズに進められる準備が整った。よって、おおむね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も抗原提示細胞の抗原提示能に対する影響に焦点を絞り、核内受容体リガンド活性を有する有機リン化合物を中心に検討を行うことで、核内受容体リガンド活性と抗原提示細胞機能修飾との関係を検証していく。
平成28年度および29年度の検討により得られた条件で、OVA抗原刺激によりDC2.4が分化成熟する過程で変動する表面抗原タンパク質の発現、およびサイトカイン産生に対する被験物質の影響を、フローサイトメトリー、リアルタイムRT-PCR法、ELISA法により検討する。また抗原提示能に対する影響については、OVA感作したマウスのリンパ球をOVA特異的T細胞として用い、この細胞に対する刺激能を、T細胞の増殖を指標に検討する。
さらに、被験物質に曝露された抗原提示細胞が、生体内において獲得免疫機能にどのような影響を及ぼすのかを確認するため、OVAパルス時に被験物質を曝露させたDC2.4を野生型マウスに移植免疫後、経時的に採血し、血清中総IgG、IgE抗体量、抗原特異的IgG、IgE抗体量の変化をELISA法により確認する。また、DC2.4移入後のマウスから採取した脾臓リンパ球について、抗原特異的T細胞増殖の変化および、その際に産生されるサイトカイン等について調べることで、獲得免疫に与える影響を検討する。
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| Causes of Carryover |
（理由）当初の計画では、平成28年度から引き続き行っている核内受容体リガンド活性を有する有機リン系難燃剤のスクリーニングにおいて、結合親和性試験に有する放射性物質など高額な試薬の購入を予定していた。しかし平成29年度も本研究室で有する既存の試薬で実験を行うことができた。また、DC2.4の移植実験によるマウス生体内での獲得免疫機能への影響について検討するために実験動物等を購入する予定であったが、条件を決めるための予備実験に留まったため、使用額が予定よりも少額となった。
（使用計画）平成30年度では、まだ実施していない有機リン系難燃剤における結合親和性の検討に用いる試薬の購入に使用する。また、DC2.4細胞の抗原提示能を検討するために行う[3H]-Thymidine取り込み試験に用いる放射性試薬の購入も行う。さらにDC2.4移植実験に用いる実験動物も多く購入する予定である。
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