海洋微細藻類を利用した資源循環型物質生産技術の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K00652
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 原田 尚志 鳥取大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (50640900)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 海洋性珪藻 / ゲノム編集 / イソプレノイド / 代謝工学

Outline of Annual Research Achievements

海洋性珪藻類は海洋における主要な藻類の一つであり、地球全体の一次生産量のおよそ20%を担う重要な生物群である。本研究では海洋性珪藻が持つこの高い一次生産能に注目し、バイオエネルギー、高機能ポリマー等の工業原料、あるいは医薬品原料として利用可能なイソプレノイド化合物の高生産技術研究を通じて、豊富な海洋環境での実用を将来に見据えた循環型・環境調和型の生産基盤技術開発を目指している。特に本研究では、羽状目および中心目の代表的な海洋性珪藻2種を生産宿主として用い、繰り返し可能なゲノム編集技術に基づく珪藻細胞の代謝経路改変を適用することにより、内在イソプレノイド、医薬品中間体およびバイオ燃料等へ利用可能な実用イソプレノイドを生産モデル分子として、大量生産に向けた基盤技術開発を行っている。
H28年度は、海洋性珪藻での高効率ゲノム編集システムの構築を目的として、珪藻プラスミドを用いたTALENゲノム編集システムの適用を検討した。珪藻細胞内でプラスミド保持に必要な複製配列、および大腸菌の接合伝達に必要な配列を連結した発現用プラスミドを新規構築した。ノックアウトターゲット遺伝子としてde novoピリミジン合成経路中のウリジン一リン酸合成酵素（PtUMPS）遺伝子を選定し、TALEN結合部位の配列のデザインならびに発現カセット構築を行った。作製した発現プラスミドを大腸菌接合伝達により珪藻に導入した結果、プラスミドを保持する複数の形質転換珪藻株の取得に成功した。現在これら珪藻株を対象に、ウラシル要求表現型を指標としたスクリーニングを行っている。今後は変異導入効率の統計処理および切断部位の配列解析を行い、TALENの効果を詳細検証する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

H28年度はTALEN発現ベクターの構築、大腸菌接合伝達を用いた珪藻細胞への導入、形質転換株の取得と機能スクリーニングまでを進めた。さらに、今後のイソプレノイド代謝経路改変を目的として、複数の内在代謝酵素のクローニングも同時に行った。したがって、ほぼ当初の計画通りの進捗と成果を得ることができている。

Strategy for Future Research Activity

次年度は引き続き、珪藻における高効率なゲノム編集技術の構築を目的に、取得した形質転換株を利用したスクリーニング、キュアリングによるプラスミド脱落条件の検討などを予定している。さらに、構築した珪藻プラスミドをベースに、RNAiコンストラクト発現プラスミドの新規構築も進める。

Causes of Carryover

別予算から旅費を支出することができたため、本年度に使用する必要が生じなかった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度は国際学会参加を予定しており、旅費・参加費の支出増が予想される。そのため、繰り越した金額を充てる。