2017 Fiscal Year Research-status Report
廃ゴム分解微生物のスクリーニングおよび分解メカニズムの解明
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16K00661
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| Research Institution | Kanto Gakuin University |
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Principal Investigator |
清水 由巳 関東学院大学, 理工学部, 准教授 (50725124)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
香西 博明 関東学院大学, 理工学部, 教授 (00272089)
清水 公徳 東京理科大学, 基礎工学部生物工学科, 准教授 (40345004)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ゴム分解菌 / 担子菌 / トランスクリプトーム解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
現在、廃ゴムの処理は燃料利用が主であるが、地球温暖化対策と自然界の物質循環に適合する社会の構築のため、廃ゴムの原型加工利用による有効なリサイクルが望まれている。そこで我々は、難分解性物質リグニンを分解する真菌類や、リパーゼ産生菌に注目し、ゴムを効率的に分解する真菌の獲得と、その分解メカニズムの解明を目的として研究を行っている。平成29年度は、次の3つを目標とした。
① 平成28年度に分離したゴム分解菌候補株17株の菌種の同定と、候補株からのゴム分解能の高い菌株の選別。
② ゴム分解に関わる遺伝子群のトランスクリプトーム解析。
③ 油脂分解能を有する真菌からの油脂分解酵素リパーゼの獲得。
①について。候補株17株を用い、ゴム添加培地、非添加培地を用いて菌を培養し生長量を測定した結果、著しく生育の良かった3株を17株から選別した。種同定の結果とあわせ、Physisporinus vitreusがブタジエンゴム、天然ゴム、スチレンーブタジエンゴムのどのラテックスを用いても著しく生育が良く、続いてHypsizygus marmoreus、Schizophyllum communeとなった。また、これら菌株については加硫ゴムの資化性も有することが判明した。②について。①の実験結果から、P. vitreus、H. marmoreusの菌株を用いて遺伝子解析を行うこととした。ゴム添加培地と非添加培地で菌を培養し、培養した菌体からRNAの抽出を行った。今後、双方の培養で細胞内に発現する遺伝子群の同定を行い、ゴム添加培地での培養でのみ発現する遺伝子群の特定を行う。③について。油分解能の高い酵母を見出し、新種であることが判明した。さらに、培養上清からリパーゼの抽出を試みたところ、至適温度の異なる少なくとも2種類の酵素を検出した。この酵母については、新規リパーゼを産生する新種として論文投稿中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
得られたゴム分解候補株の同定が終了した。多くが白色腐朽菌であった。これらの菌にゴムラテックスを資化させた後、TLCによりゴム分解産物の検出を行ったところ、菌を作用させていないラテックスサンプルでは検出されない特異的なスポットを検出することができた。
TLCによるゴム分解産物の検出に用いた培養条件で、菌を培養したときに発現する遺伝子について、トランスクリプトーム解析を試みた。当初、トランスクリプトーム解析に用いる菌株は、ゴム分解候補株のうちゲノム情報が蓄積されているヒラタケ、エノキタケを予定していた。しかしながら、本実験に用いている固形培地では、ヒラタケ、エノキタケ共に固形培地内部に菌糸を伸ばし生育したため、固形培地中からの集菌方法を模索したが困難であることが分かり、これら2菌種をトランスクリプトーム解析に使用することを断念した。そこで、他のゴム分解候補株の中から、集菌が容易でゴム資化性が著しかったP. vitreus、H. marmoreusを用いることにした。トランスクリプトーム解析を行うにあたり、対照として、炭素源にグルコースを加えた培地を用い培養を行った。当初、グルコース添加培地であれば、これら2菌種は良く増殖するであろうと考えていた。しかしながら、菌の生育はあまりよくなく、菌体を回収するのに時間がかかってしまった。このような理由で研究に遅れが生じてしまった。
平成29年度は、固形ゴムや加硫ゴムを用いた資化性試験も行った。その結果、ゴム分解候補株の中には、固形ゴムや加硫ゴムを炭素源として利用できる株があることが判明した。菌を作用させた後の固形ゴム表面を、走査型電子顕微鏡を用いて観察したところ、菌糸が固形ゴム内部に潜り込んだ像が得られた。さらに、加硫ゴムについては、ゴム表面に薄い膜上の構造物が形成された。これは走査型電子顕微鏡像から加硫ゴムの分解物であると予想した。
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| Strategy for Future Research Activity |
トランスクリプトーム解析については、平成30年5月中にRNAの抽出が終了し、6月からは解析を始める予定である。9月にはゴムの資化に関わる遺伝子群を特定でき、個々の遺伝子について機能解析を始める。
TLCにより検出されたゴム分解産物については、NMRやLC-MSを用い構造決定を行う。その結果から、本プロジェクト初年度に得られたNMRの結果とのすり合わせを行う。
固形ゴムや加硫ゴムを用いた資化性試験と、その分解産物の構造決定をNMRやLC-MSを用い行う。さらに分解産物を確認できた培養条件では、菌が固形ゴム分解に関わる酵素を培地中に分泌すると予想し、その酵素の抽出を試みる。手法としては、分解産物を確認できた培養条件で菌を培養し、菌体内で発現する遺伝子群をトランスクリプト―ム解析により行う。あるいは、分解産物が確認できた培養条件で菌を培養し、菌体外に分泌されたタンパク質を抽出しプロテオーム解析を行うことが考えられる。しかしながら、これらの解析法はコストがかかるため、菌体外に分泌されたタンパク質をアクリルアミドゲル2次元電気泳動により検出し、ゴム分解に関与するタンパク質の同定を試みる。
他方、油分解能の高い、新規リパーゼを産生する新種酵母については、この新規リパーゼの抽出同定を目指す。現在、Native PAGE法を用いた酵素検出はできているが、ペプチドシークエンスによるアミノ酸配列解析を行うにはタンパク質量が十分ではない。そこで、タンパク質の濃縮とSDS-PAGEによる検出を行う。
担子菌酵母を用いた細胞外分泌系酵素の分泌メカニズムの解析については、細胞外分泌に関与すると予想されるタンパク質CAP64と標識タンパク質mcherry、あるいはHis-tagとの融合タンパク質を作ることに成功したため、CAP64の細胞内局在性を免疫電顕法を用いて行う予定である。
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| Causes of Carryover |
平成29年度に、トランスクリプトーム解析を終了する予定であったが、この解析に十分な量のRNA抽出を行うのに時間がかかってしまい、トランスクリプトーム解析を平成30年度に行う予定となってしまった。このため、平成29年度の予算に計上していたトランスクリプトーム解析に必要な費用が未使用となっている。平成30年度にこの解析を行うため、平成30年度の予算に計上する。
また、当初の研究計画に従い、ゴム分解酵素の遺伝子のクローニング、ゴム分解酵素の抽出と精製を進めていきたいと思う。このため、分子生物学的、生化学的な実験で用いる消耗品を購入する。
細胞外分泌酵素の分泌メカニズムの解析については、C. neoformansを用い、Cap64を蛍光タンパク、あるいはHis-tagを用いて標識するところまで準備ができたので、Cap64の細胞内局在性を電子顕微鏡を用いて解析する。そのため、免疫電顕に必要な消耗品を購入する。
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