2016 Fiscal Year Research-status Report
マツタケの特徴的な香りの生合成遺伝子を単離してヒラタケに導入し，その香りを作る
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16K00839
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| Research Institution | Nagaoka National College of Technology |
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Principal Investigator |
田崎 裕二 長岡工業高等専門学校, 物質工学科, 准教授 (90390434)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | マツタケ / 菌糸体 / 香気成分 / 桂皮酸メチル / 生合成酵素 / フェニルアラニンアンモニアリアーゼ / 桂皮酸カルボキシルメチルトランスフェラーゼ / 遺伝子発現 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
香りは食品の価値を決める重要な要素の一つである．食用キノコにおいては，マツタケの独特の香りが日本人にたいへん好まれている．その香りの主成分は桂皮酸メチルであるが，この成分がなぜマツタケとその近縁種のキノコでのみで検出されるかは分かっていない．
そこで，本研究では，桂皮酸メチルの生合成の制御機構（生合成機構）を，桂皮酸カルボキシルメチルトランスフェラーゼ（CCMT）に焦点を当てて，遺伝子レベル・蛋白質レベルから明らかにすることを目的とした．また，マツタケ風味の新品種キノコの作出の先駆けとして，ヒラタケにCCMTを付加して，ヒラタケにおけるマツタケの特徴香の生合成を調べる．
平成28年度において，マツタケの桂皮酸メチル生合成におけるキー酵素CCMTをコードする遺伝子cDNAの単離を試みた．これまでに，マツタケ菌糸体の培養途中にPhe（桂皮酸メチルの材料）を添加したところ，菌糸体中の桂皮酸メチル生合成酵素の一つと考えられているフェニルアラニンアンモニアリアーゼ2（TmPAL2）遺伝子の発現量が，桂皮酸メチル含量とともに増加することを明らかにしている．よって，CCMT遺伝子もPhe添加により発現量が増加すると考えられる．初めに，Phe（終濃度6 mM）添加及び無添加の培地で培養したマツタケ菌糸体よりトータルRNAを抽出した．その後，それらを用いて各菌糸体で発現する全mRNAの配列解読（次世代シーケンスRNA-Seq）を実施した．現在，配列の解読が終了し，Phe添加で発現量の増加する遺伝子cDNAの中からCCMT遺伝子に相当すると考えられるcDNAを選択している途中である．一方で，Phe添加で発現量の増加する遺伝子cDNA中にTmPAL2遺伝子が含まれていることを確認している．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
平成28年度の研究実施計画①『CCMT遺伝子cDNAの単離と配列解読』において，各菌糸体のトータルRNAサンプルより，純度や断片サイズなどが良好なライブラリーを調製した．その後，各菌糸体で発現する全mRNAの配列解読（次世代シーケンスRNA-Seq）を行った．リード配列のアセンブル，アセンブルContig配列へのマッピング，ヒートマップの作製まで順調に行えた．しかし，その後のアノテーションに予想以上の時間を費やしたため，Phe添加で発現量の増加する遺伝子の検出に時間を要した．
計画②『桂皮酸メチルの材料添加による菌糸体の酵素CCMT活性と桂皮酸メチル生合成の効果の解析』及び計画③『CCMT遺伝子の子実体・菌糸体での転写量測定』において，計画①において，CCMT遺伝子cDNAの単離がなされていないため，未着手のままとなっている．
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| Strategy for Future Research Activity |
マツタケの特徴香である桂皮酸メチルの生合成機構を解明するため，平成29年度においては，マツタケの桂皮酸メチル生合成酵素CCMTをコードする遺伝子cDNAを単離する．また，マツタケの菌糸体及び子実体におけるCCMT酵素活性・mRNA発現と桂皮酸メチル量の関係を明らかにする．さらに，ヒラタケにCCMT遺伝子を導入し，合成した酵素CCMTの桂皮酸メチル生合成に対する効果を明らかにするとともに，ヒラタケを用いて桂皮酸メチルを生合成する新品種キノコの作出の可能性を検討する．これらの目的を達成するため，以下の②～④の研究の実施を予定している．
計画②『桂皮酸メチルの材料添加による菌糸体の酵素CCMT活性と桂皮酸メチル生合成の効果の解析』 桂皮酸（桂皮酸メチルの材料）を添加した培地で菌糸体を培養し，CCMT活性と桂皮酸メチル量を測定し，それらの相関を調べる．
計画③『CCMT遺伝子の子実体・菌糸体での転写量測定』 単離したCCMT遺伝子の転写量を，リアルタイムPCRを用いて測定する．測定試料には，平成25～28年度に取得した子実体の生長過程及び各部位，収穫後保存した子実体及び計画②で取得した菌糸体からトータルRNAを抽出して用いる．これにより，子実体と菌糸体における遺伝子mRNAの発現の量，場所，時期，誘導といった発現様式を調べる．
計画④『PALとCCMTの遺伝子の転写量測定』においては，マツタケ子実体・菌糸体の各種サンプルよりトータルRNAを抽出した後，PALとCCMTの遺伝子の転写量をリアルタイムRT-PCR法で測定する．測定試料のマツタケ子実体の傘，ひだ，柄，石づきの各部位においては，既にトータルRNAを抽出している．
CCMT遺伝子の単離が予定より遅れているため，当初の計画より進行が遅れているが，研究内容に関しては変更せずに，研究を遂行する．
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