2016 Fiscal Year Research-status Report
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16K00848
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
早川 清雄 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助教 (00368292)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 脂質合成 / 炎症応答 / マクロファージ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は，生活習慣病の基盤病態として，炎症の適切な収束が妨げられた状態と考えられる「慢性炎症」に着目して研究を進めている．炎症応答は本来，生体の防御反応であり，生体にとって異変がおこると自然免疫応答を活性化させ，サイトカイン，ケモカインといった微量で強力な生理活性物質を放出する．慢性炎症をコントロールするためには，その分子メカニズムの解明が非常に重要な課題である．近年，Toll-like receptor(TLR)やInflammasomeを介した免疫応答・炎症応答の活性化と脂質代謝・合成が密接に関連していることが報告されている．そこで，Raw264.7細胞やC57BL/6マウスからbone-marrow derived macrophage(BMDM)を調整し，LPS等で細胞を処理するとカスパーゼのmRNA発現が時間依存的に急速に誘導され，また，脂質合成に関わる遺伝子発現も８時間をピークに誘導されることがわかってきた．脂質合成に関連した遺伝子発現の変化に対して，カスパーゼが関与しているのかどうかを検討するため，細胞をカスパーゼの阻害剤（Z-VAD-FMK）で処理した結果，脂質合成に関連した遺伝子発現が有意に抑制された．さらに，シグナル経路に関連することが予想されるカスパーゼの遺伝子発現を，合成siRNAを用いてノックダウンすると同様に抑制された．また，脂質合成に関わる分子の活性化についてウェスタンブロット法を用いて解析すると，カスパーゼをsiRNAでノックダウンした場合に抑制されることがわかった．現在，カスパーゼと脂質合成に関わる分子は，共焦点レーザー顕微鏡を用いた解析により，刺激に依存して共局在することから，それらの分子の会合性について免疫沈降法を用いて検討を行っている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、炎症応答と脂質代謝・合成のクロストークに着目して研究を進めている。
これまでに、qRT-PCRやウェスタンブロット法を用いた解析、さらにマクロファージに対して阻害剤やsiRNAを用いた実験を進め、予想された結果が得られている。平成２９年度においては、免疫沈降法を用いた会合性を検討する実験系の検討をはじめ、炎症シグナルと脂質代謝・合成シグナルの新しい関係性が明らかになりつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
現時点では、当初計画の通り実験を進め、予想された結果が蓄積されつつある。今後も、計画に沿った形で実験を進めていく予定である。当初の計画書においては、脂質の細胞内蓄積を蛍光色素を用いてプレートリーダーで解析する計画であったが、GC-MSを用いて解析をすることができる環境となったことから、より定量性を高め脂質の解析をすることができる状況となったことが変更点である。現在、解析法について至適な条件を検討中である。
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| Causes of Carryover |
炎症に伴う細胞内脂質の解析について、当初計画では蛍光試薬・プレートリーダーで行う予定であったが、GC-MSを用いて詳細に解析をすることができる状況となった。そのため、本年度購入予定であった試薬や細胞培養用プラスチック器具を、次年度に購入することとし、解析条件の検討を進めている。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
198,654円の使用計画としては、細胞培養用関連試薬・細胞培養用プラスチック器具および脂質抽出用試薬などの消耗品を購入するための予算とする。
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