2017 Fiscal Year Research-status Report

Y2受容体発現を指標とする脂質異常症改善栄養素・薬剤の探索

Research Project

Project/Area Number	16K00860
Research Institution	University of Hyogo
Principal Investigator	加治秀介兵庫県立大学, 看護学部, 教授 (90224401)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	ニューロペプチドY / Y2受容体 / マクロファージ / コレステロール逆転送 / プロトカテク酸 / ABCG1
Outline of Annual Research Achievements	過食やストレスでニューロペプチドY（NPY)が交感神経末端より放出されることが知られるが、NPY受容体の一つ、Y2受容体（Y2R)の遺伝子上流SNPsと血中HDL-C値が健常者で関連すること、血中HDL-C値が高くなるSNPでは培養マクロファージに一過性遺伝子上流導入で転写活性がみられること、さらにY2R拮抗薬BIIE0246による遺伝子発現についてのマイクロアレイ解析でHDL-C値が高くなる機序としてコレステロール逆転送を促進する可能性が考えられた。そこでマクロファージにおけるコレステロール逆転送効果について検討した。最初に培養THP-1より分化させたマクロファージにおいてY2R特異的リガンドであるPYY3-36のコレステロール逆転送に関わる代表的分子であるABCA1, ABCG1, SR-B1 mRNAへの影響をreal time PCRで比較した。その結果、PYY3-36は200nMまで用量依存的にABCG1 mRNAを増加させた。一方ABCA1, SR-B1 mRNAは有意に変化しなかった。次にコレステロール逆転送が報告されている栄養素のうち、ABCG1 mRNA発現を増加させるものとして、ポリフェノールがあり、中でもクロロゲン酸（CGA）やアントシアニンが吸収後変化するプロトカテク酸（PCA）に着目した。10μMのPCAはABCG1, ABCA1 mRNAを共に有意に増加させたが、CGAはいずれのmRNAも有意に変化させなかった。そこでマクロファージY2R mRNAへの効果を検討した結果、非添加では検出されなかったが、PCAの添加で検出可能なレベルへの増加がみられた。以上の結果はPCAがコレステロール逆転送を促進する機序の一部に、Y2Rを介するNPY作用増強の関与を示唆した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 前年度は肝細胞HepG2で転写活性のあるY2R遺伝子上流SNPのタイプではNPYが血中HDL-C値が低くなることより、HepG2でY2R発現を抑制する栄養素の探索、Y2R拮抗薬の探索をいくつかのHDL-C値を上昇させる作用のある栄養素のHepG2細胞における影響を確認し、一部にY2R発現を抑制する傾向のある栄養素ないし有意に発現を抑制する栄養素を見出した。このためHepG2細胞での拮抗薬の探索はH29年度に実施予定としていた。しかしTHP-1細胞からホルボールエステルで分化させたマクロファージに転写活性のあるY2R遺伝子上流SNPsのタイプではNPYが血中HDL-C値がより高い機序の一部がマイクロアレイの結果、明らかになり、当初予定していなかったマクロファージでのY2R発現を促進する栄養素も探索することになった。そこで今年度はこの点の検討が中心となった。以上よりおおむね順調に進んでいると考えている。
Strategy for Future Research Activity	１）マクロファージにおけるY2R遺伝子発現促進を指標とする薬剤の探索マイクロアレイの結果からHDL機能のうちマクロファージからのコレステロール逆転送機能の促進にY2Rが関与することを報告してきた。そこでコレステロール逆転送機能を増加させる栄養素に続いて、今後は候補分子や薬剤について、培養マクロファージに添加して、逆転送機能分子である、ABCG1, ABCA1, SR-B1遺伝子発現への影響を確認する。確認出来たらこれらの分子や薬剤によるY2R遺伝子発現への影響をリアルタイムPCRで半定量し、これらの分子や薬剤のコレステロール逆転送機能にY2Rを介するNPY作用の増強が関与するか否かについて検討する。２）肝細胞におけるY2R拮抗薬の探索これまで用いたY2R拮抗薬BIIE0246は活性は強いが特異性にやや問題があるので、他の拮抗薬JNJ31020028やSF-11などの候補薬剤を入手し、HepG2細胞への網羅的遺伝子発現への影響をマイクロアレイ解析により検討する。３）成果をまとめて論文等で公表する。
Causes of Carryover	次年度使用額が生じた理由培養マクロファージでのコレステロール逆転送系におけるY2Rの効果検討の実験が中心となり、高額の費用がかかるHepG2でのY2R阻害薬に関するマイクロアレイの実験を次年度に変更したため。次年度使用計画マクロファージのコレステロール逆転送系における栄養素に加えて薬剤のY2Rへの影響を検討すること、さらにHepG2での新たなY2R阻害薬を入手し、網羅的遺伝子発現への影響をマイクロアレイ解析を行うことに使用する。次年度は所属変更に伴い、一部不足備品の購入にも充てる予定である。これまでの成果を論文としてまとめる費用にも使用する。