高コレステロール食慢性投与によるアルツハイマー型脳機能障害の解明と予防食の探索

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K00894
• Research Institution: Nakamura Gakuen University Junior College
• Principal Investigator: 森脇 千夏 中村学園大学短期大学部, 食物栄養学科, 准教授 (90280289)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤倉 義久 大分大学, 医学部, 教授 (10165368) ; 伊奈 啓輔 大分大学, 医学部, 准教授 (20203193) ; 千葉 政一 大分大学, 医学部, 助教 (20457633) ; 酒井 久美子 大分大学, 医学部, 助教 (60225753)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 高コレステロール負荷食 / 脳機能 / アルツハイマー / 遺伝子解析 / メタボローム解析 / 高コレステロール血症

Outline of Annual Research Achievements

C57bl6雄性10週齢マウスに高コレステロール食（HC食（2%-，0.2%-，0.02%-））および対照食（AIN93G）を経口慢性投与した。BioLis15ineo（関東化学）を用い血清脂質動態を評価した。飼育4か月でTC,LDL,HDLが2％HC食で有意に増加し、TGが有意に低下した。また、血清レプチン、インスリンの有意な増加も認められた。LDL,TGは2％HC食負荷後、3日目で有意に増加しており、負荷後直ちに血清脂質動態が変化することが分かった。さらに飼育4か月で視床下部ヒスタミン含有量が低下し、行動解析では社会性行動、短期記憶能が低下した。形態学的変化は、抗HDC陽性反応領域が減少し、神経細胞の萎縮、細胞内ゴルジ複合体の空胞化が認められ、神経ヒスタミン細胞内にアミロイドβの蓄積がみられた。慢性的HC食の負荷によって、高コレステロール血症を発症しAD様の脳機能障害と行動変化が観察された。メタボローム解析を用いて脳代謝物を網羅的に解析した結果、2％HC食慢性投与では有意に脳内コレステロール量が低下していた。Western blotting法により、視床下部におけるコレステロール合成能について検討したところHMGCRなどのコレステロール合成経路がたんぱく質レベルで抑制され、AMPKα1、HDCが低下していた。マイクロアレイ解析では、p<0.01かつRatio>2.0の遺伝子が75genes検出された。これらをGene Ontology解析を行った結果、2％HC食慢性投与群では脳内の摂食シグナル因子であるAGRPの活性化と視床下部に特徴的なホルモンの分泌、またシグナル伝達ペプチドの発現が亢進していた。炎症性のシグナルペプチドも増加しており、視床下部の神経細胞は持続的なレプチン刺激によって、炎症が励起されそれによってAGRPの異常発現活性化が伴ったと推測できた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成29年度当初計画では、平成28 年度の結果から脳機能障害のターゲットを解明することで、これらに予防的に働く食品成分を検索することを予定していた。予測する食品成分として食事性コレステロール吸収阻害（水溶性食物繊維；海藻・果物・野菜ほか）、コレステロール合成阻害（βグルカン；大麦、ジンゲロール・シトラール；しょうが、EPA・DHA；青魚、フェルラ酸；米ぬかほか）、脳内摂食調整成分（γオリザノール；玄米)が挙げられた。特に日本人のエネルギー摂取の約５０％程度を占める穀物に含まれる成分に着目し検討することで予防成分を多く摂取できる可能性を予測していた。
しかし、C57bl6雄性マウスに高コレステロール食を慢性投与することによって高コレステロール血症を発症することは分かっていたが、負荷後どの程度の期間で血清脂質動態、特にLDLが上昇するのかの検討が遅れていたため、食品成分の決定にも遅れが生じた。
平成29年度の成果から高コレステロール食負荷後3日で血清脂質動態が変化することから、今後は食事性コレステロール吸収阻害成分に着目し研究を行うこととした。

Strategy for Future Research Activity

１．高コレステロール食慢性投与＋予防成分によるマウス実験を行う。
食事性の高コレステロール負荷による脳機能障害に予防的に働く食品成分として、食事性コレステロール吸収阻害（水溶性食物繊維；海藻・果物・野菜ほか）を選択し、高コレステロール負荷食（2.0％cholesterol-conteiningAIN）に添加し慢性的に経口投与する。動物実験等を同様に行い、その効果を比較検討する。
２．平成29年度までの成果を報告する。

Causes of Carryover

研究の遅れによって予定していた実験経費を使用しなかったため、次年度使用額が生じた。平成29年度に予定していた実験を一部繰り越し、その費用を物品費およびその他として使用する。予定している実験は以下の通りである。
1．食行動、飲水行動、一般活動量をACTIMO system (sintecno.,Co.,Ld.,Fukuoka,Japan)を用いて定量評価する。さらにrota-rode 試験およびSMART system(Toyo Ind.,Co.,Ld.,Aichi,Japan)により Open field 試験、条件付けによる記憶学習能、ソーシャルインタラクションの行動解析を行う。2. 行動解析後、深麻酔後に組織固定液にて灌流固定し検討臓器の摘出を行う。その後、免疫染色により神経細胞数の減少・分泌能低下を形態学的に検討する。3．行動解析後、断頭の後、視床下部を摘出し、ただちに液体窒素中にて凍結し-80℃で保存し①Western blotting、②遺伝子発現解析、③メタボローム解析を行う。4．血液性状についてはBioLis15i neo、ELISAを用いて解析する。