2016 Fiscal Year Research-status Report
生活習慣の乱れから起こるNAFLD/NASHの診断キットの開発
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16K00931
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| Research Institution | Hiroshima International University |
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Principal Investigator |
長嶺 憲太郎 広島国際大学, 薬学部, 准教授 (80412352)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | NASH / バイオマーカー / 遺伝子診断 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、非アルコール性脂肪肝炎（NASH）患者の早期発見のための非侵襲的なバイオマーカーの同定を目的としている。これまでに本研究室では、肝実質細胞株に生理的条件下に近いフルクトースを処理することで細胞内AGEsを多量に形成させることに成功し、フルクトース処理した細胞内に有意に増加されたAGEs化蛋白質を探索した結果、遺伝子発現に関与している蛋白質Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein M (HNRNPM) を同定してきた。
HNRNPMが糖化されることによってmRNAへの結合能に変化が見られた候補遺伝子をRIP-Assay及びDNAマイクロアレイ解析を行い、162種類見いだした。これらのうち12種類の遺伝子産物は、細胞外へ分泌されることを見いだし、診断マーカーの候補になる可能性を示した。そこで、NASH病態モデルマウスの肝臓を用いて、12種類の中からNAFLD/NASH診断候補遺伝子を絞り込むこととしたが、これら12種類に発現量の変化が見られなかった。
次に、HNRNPMの発現量を抑制するRNA干渉法を用いて、NAFLD/NASH関連遺伝子の選定を試みた。すなわち、RNA干渉によってHNRNPMの発現を抑制したヒト肝癌細胞株Hep3Bを用いてDNAマイクロアレイ解析した。この結果、166遺伝子が1.5倍以上増加しており、104遺伝子が1.5倍以上減少していた。これらの遺伝子について細胞内の局在について解析し、特に細胞外で機能すると同定された遺伝子のうち、発現が増加したものは10遺伝子あり、減少したものは4遺伝子見出された。
今後、変化が見られた遺伝子の解析を進める予定である。特に、細胞外で働く遺伝子については、NASHのバイオマーカー候補遺伝子となる可能性があるため詳細な検討を行うつもりである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度では、NAFLD/NASH診断候補遺伝子の探索として、RIP-Assay及びDNAマイクロアレイ解析によって得られた162遺伝子の中から、ジーンオントロジー解析を行い、細胞外で働く遺伝子を12種類まで絞り込んだ。これら12種類の遺伝子に関して、コントロール及びNASH病態モデルマウスの肝臓を用いてqRT-PCRにより検討し、組織当たりの遺伝子発現量の変化を数値化して精査したが、これら12種類に発現量の変化が見られなかった。
一方で、目標の達成に困難が生じたときの対応についても計画していた。すなわち、最終的に有意差のあるNAFLD/NASH特異的遺伝子が得られないことが想定される場合、別の方法を用いてNAFLD/NASH関連遺伝子の選定を行うこととしていた。この時のアプローチとしては、HNRNPMの発現量を抑制するRNAiを用いた方法であり、ピンポイントにHNRNPMのみの機能を減弱させることで見られる遺伝子発現量の差を検討することとした。この結果、166遺伝子が1.5倍以上増加しており、104遺伝子が1.5倍以上減少していた。これらの遺伝子について細胞内の局在について解析し、特に細胞外で機能すると同定された遺伝子のうち、発現が増加したものは10遺伝子あり、減少したものは4遺伝子見出された。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞外で働くとされるタンパク質が見出されたことから、これらの遺伝子（遺伝子産物）が実際に細胞外で検出できるかを検討する。特に、これらの遺伝子（遺伝子産物）の中にはエクソソームで働くものも含まれていたため、これらの中に診断マーカーとなりうる遺伝子があるか検討を進めるつもりである。そのためには、簡便なエクソソームの抽出方法を確立しなければならない。現在、様々な方法の抽出技術が確立されている。その中で、後述する遺伝子増幅に繋げるために最適な抽出法を選ばなければならない。まずは、培養細胞を用いて検討を行う。
遺伝子診断のためには、特異的な遺伝子増幅用プライマーを設計しなければならない。特に今回の計画では、等温遺伝子増幅法であるLAMP法を用いた迅速判定を考えている。特異的遺伝子に対する遺伝子増幅用プライマーの設計は、4種類の候補プライマーを作製する。これまでの経験上、4種類作製すれば特異的かつ短時間に増幅できるプライマーができると考えている。反応試薬は、ドライ型試薬を想定しておりエクソソーム抽出物を入れるだけで反応できる系の確立を目指したい。
一方で、研究を遂行する上での課題もある。すなわち、実際にヒト検体を用いた場合のエクソソーム抽出効率および遺伝子増幅効率への影響である。これについては、NASH患者および健常者の肝組織や血清を入手し検討する予定である。さらに、ここまでの研究で候補が得られなかった場合、上記NASH患者の組織を用いた遺伝子探索も進める予定である。
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