ターゲット・プロテオミクスによる核果類アレルゲンタンパク質の一斉定量法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K00939
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 一法師 克成 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品研究部門 食品健康機能研究領域, 上級研究員 (30355606)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: ターゲット・プロテオミクス / モモ / アレルゲン / 定量 / LC/MS/MS / Pru p 1 / Pru p 3 / 安定同位体標識内部標準ペプチド

Outline of Annual Research Achievements

ターゲット・プロテオミクスによるモモアレルゲンタンパク質Pru p 1、Pru p 2、Pru p 3およびPru p 4の一斉定量法を開発するため、以下の研究を行った。
UniProtKBに登録されているPru p 1～4のアミノ酸配列情報を用いて、in silicoでのトリプシン消化を行い、安定同位体標識内部標準ペプチド（AQUAペプチド）に適した配列を持つ、Pru p 1～4に対応した4つのペプチドを選定し、それらを合成した。LC-MS/MSの質量分析部へAQUAペプチドをインフージョンし、フルスキャン測定およびプロダクトイオン測定を行い、これらペプチドのMRMトランジションを決定した。次に、AQUAペプチドおよびモモタンパク質トリプシン消化物を用いて、オクタデシルシリル（C18）基を持った逆相クロマトグラフィーや親水性相互作用クロマトグラフィー（ZIC-HILIC）の分離モード、水/アセトニトリルの比率等の移動相などの液体クロマトグラフィー（LC）条件を検討し、Pru p 1およびPru p 3の分析に適したLC条件を決定した。Pru p 2およびPru p 4については、トリプシン消化により生成する、AQUAペプチドに対応した内生ペプチドを検出できなかった。
Pru p 1およびPru p 3の定量法について、マトリックスへ添加したAQUAペプチドの濃度系列の測定による直線性の確認、モモ生鮮品を対象に日内変動と日間変動の調査による再現性の確認を行い、定量法の妥当性を評価した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Pru p 2およびPru p 4については、トリプシン消化により生成する、AQUAペプチドに対応した内生ペプチドを検出できず、定量法を開発することができなかったため。モモのPru p 2およびPru p 4含量が、本分析法の検出下限値以下であることなどが、検出できない理由の一つと考えられる。

Strategy for Future Research Activity

平成29年度は、平成28年度と同様の研究手法を用いて、オウトウのアレルゲンタンパク質Pru av 1、Pru av 2、Pru av 3およびPru av 4の一斉定量法を開発する。

Causes of Carryover

実験補助員の雇用が遅れ、人件費が見込額より少なくなったことや有機溶媒の使用量が少ない定量法を開発したため、有機溶媒の費用が少なくなったことなど。

Expenditure Plan for Carryover Budget

試薬、分析カラムやバイアル等の物品購入に使用する。