長期保管可能フィーダー細胞層を用いた造血機能の生体外再構築

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K01348
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 三好 浩稔 筑波大学, 医学医療系, 講師 (70292547)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 二宮 治彦 筑波大学, 医学医療系, 教授 (10198533) ; 上妻 行則 筑波大学, 医学医療系, 助教 (90550145)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 造血幹細胞 / ストローマ細胞 / さい帯血 / 凍結保存 / 分化・増殖 / 三次元培養 / 共培養 / ティッシュ・エンジニアリング

Outline of Annual Research Achievements

造血幹細胞移植の治療成績を向上するために、あるいは、さい帯血移植の応用範囲を広げるために、生体外で効率的に未分化な造血系細胞（以下、造血幹細胞）を増幅できるような培養系を確立する必要がある。また、造血幹細胞だけでなく、血小板を産生する巨核球など他の造血系細胞を選択的に増幅できる培養系を確立することの意義も大きい。本研究では、ヒトさい帯血由来の造血系細胞を三次元培養系においてフィーダー細胞層上で共培養することにより、未分化な造血系細胞などを生体外で増幅できる三次元培養法を開発することを目的としている。このとき、共培養前にフィーダー細胞の増殖を三次元凍結保存処理によって抑制しておくことで、造血系細胞を効率的に増幅することを目指す。
前年度の結果において、ヒト由来のストローマ細胞株を用いてさい帯血中の造血幹細胞を増幅できることが確かめられた。しかし、ストローマ細胞株は自己の細胞ではないため、臨床に使用できない。そこで、本年度はさい帯血細胞を２回に分けて播種して培養することで、１回目の細胞がストローマ層として作用し、造血幹細胞を増幅できるかどうかを検討した。その結果、１回目に播種した細胞の密度が低いと、造血系細胞はほとんど増幅されなかった。また、これまで３次元培養用担体として用いてきた polyvinyl formal 樹脂は生体適合性ではないため、担体の検討も並行して行った。その結果、生体適合性材料であるポリ乳酸の多孔質体を、担体として使用できることがわかった。
血小板産生を目的とした巨核球への分化実験については、培養実験を本格的に開始した。分化を促進するための thrombopoietin 濃度の至適濃度を決定したのち、培養さい帯血の密度が巨核球の増幅に及ぼす影響について検討した。その結果、培養密度が高い方が高い増幅度が得られることがわかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

未分化な造血系細胞を増幅するための研究については、ほぼ計画通りに進行している。さい帯血細胞を２回播種して培養する実験では、現時点までに良好な結果は得られていない。しかし予備的な検討から、培養密度を変更することで増幅度を向上できる可能性が示唆されていることから、至適な密度を決定するために継続して検討を行う。
巨核球細胞への分化実験については、当初の予定よりも早く研究が進んでおり、比較的良好な増幅度の結果が得られている。全細胞中の巨核球細胞の割合がまだ低いものの、細胞の播種条件を検討することで改善できると考えている。
以上のことから、研究はおおむね順調に進行している。

Strategy for Future Research Activity

ヒトさい帯血に含まれている未分化な造血系細胞を増幅するための実験では、自己のストローマを用いた２回播種培養実験において、培養密度と増幅度の関係を調べる予定である。また、さい帯血細胞をいくつかの分画にわけ、ストローマ細胞や造血幹細胞源として有効な分画を利用することで、効率的に造血系細胞を増幅するための条件を探索する。
巨核球の増幅実験では、現在の培養実験を継続するとともに、培養細胞の評価方法についても検討する。培養巨核球の成熟度を評価するために核の多倍体化を測定し、培養条件の違いが巨核球の成熟に及ぼす影響について調べる。