2016 Fiscal Year Research-status Report
細胞形状の時空間制御に伴う細胞骨格・小器官のダイナミクスと細胞遊走機序の解明
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16K01350
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
菅原 路子 千葉大学, 大学院工学研究科, 准教授 (30323041)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 細胞遊走 / 細胞骨格 / 光応答性培養基板 / 細胞形状制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞が気質上を這い回る細胞遊走の制御は，再生医療支援や薬物治療支援を始めとする次世代の医工学分野における基幹技術であり，その確立のためには遊走機序の解明は不可欠である．これまで，細胞形状の非対称性，すなわち形状極性の形成や，核と微小管形成中心を結ぶnuclear-centrosomal axis (NC axis)が，細胞遊走と関連することは知られていたものの，それを明確に理論立てて裏付ける研究は皆無であり，細胞遊走機序の全容解明には程遠い状況であった．そこで本研究では，細胞遊走に関わるアクチン細胞骨格，およびNC axisに関わる微小管のダイナミクスを細胞遊走と関連付け，形状極性がより支配的となる細胞遊走機序の「なぜ」を多様な方面から掘り下げて明らかにし，そのメカニズムを利用した細胞遊走の制御記述を確立することを目指す．
実験では，形状極性を一様とした条件下でのNC axisと細胞遊走の関連を明らかにすべく，紫外光照射による光応答性培養基板を用いて細胞の同時大量パターニングを行うこととし，初年度はその実験系構築に取り組んだ．現有の蛍光・位相差顕微鏡と電動ステージを組み合わせるとともに，低倍率における紫外光照射によるパターニングマスクの基板への投影を確認した．
また，細胞骨格および微小管のダイナミクス観察を目的とし，細胞に遺伝子導入する蛍光プローブを検討した．しかし，遺伝子導入効率が高くなく，また導入された場合にも得られる蛍光強度が十分ではない問題があった．骨格構造のクリアな観察を考慮すると，免疫蛍光染色も視野にいれる必要があると考えられた．ダイナミクス観察が不可能となるものの，観察開始から様々なタイミングにおいて，細胞を固定し，免疫蛍光染色することにより，統計的に観察結果を解析ことに方向転換を検討した．また，それに見合う定量解析用プログラムの構築に取り組んだ．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
実験系の構築，細胞遊走に伴う細胞骨格観察方法の検討，と予定していた研究実施計画を遂行できた．観察方法の検討においては，当初予定の手法ではうまくいかない可能性が高いことも見出されたものの，代替方法を選択することにより，研究内容を変えることなく次年度に向けて研究を遂行できるものと考える．
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は，初年度に構築した要素手法を組み合わせ，形状極性と細胞骨格の関係を明らかにすることが可能か検討する．すなわち細胞の大量パターニングを行い，その直後から様々なタイミングにおいて細胞を固定・免疫蛍光染色したサンプルを作成し，構築中の細胞骨格定量解析用プログラムによって細胞骨格の時間変化を統計的に捉えることが可能であるかを検討する．検討を通して，必要に応じて各実験の要素手法や解析手法を見直し，実験方法および解析方法の改善を行う．
手法が確立したところで，細胞をパターニングする際のフォトマスクを変え，細胞底面形状を様々なに変化させ，それがアクチン骨格および微小管の配向に及ぼす影響を調べる．また，合わせて細胞内小器官の局在も調べ，静的な環境下での骨格の配向特性を明らかにする．本実験では，細胞種を限定せず，HeLa細胞，NIH 3T3細胞をはじめとする様々な細胞において実験を行う事により，NC axisが細胞種依存である理由の解明を目指す．
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| Causes of Carryover |
申請時に顕微鏡用電動ステージの購入を予定していたものの，他の予算から別途購入したことにより，次年度使用額が生じた．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度により発生すると予想される，消耗品（特に試薬類），および国外旅費に使用する予定である．
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