2018 Fiscal Year Annual Research Report
Live cell imaging of regulated necrosis
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16K01378
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
村井 晋 東邦大学, 医学部, 助教 (90287540)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中野 裕康 東邦大学, 医学部, 教授 (70276476)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ネクロプトーシス / RIPK3 / MLKL / HMGB1 / LCI-S / １分子FRET / 計画的ネクローシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々がFRETプローブSMARTは計画的ネクローシスの誘導によってリン酸化され活性型となったRIPK3をモニターするプローブとしてデザインでされている。そのことを確認するためRIPK3の発現をsiRNAによってノックダウンしたL929細胞において、計画的ネクローシス誘導後のFRET解析を行った。その結果、計画的ネクローシスは起こらずFRET現象も起こらなかった。この結果は前年度までのRIPK3のキナーゼ活性の阻害剤を用いた実験結果と一致するものであった。さらにRIPK3の基質であり計画的ネクローシス実行分子であるMLKLの発現をsiRNAによってノックダウンしたところ、RIPK3は発現しているにも関わらず、FRETは起こらなかった。MLKLのノックアウトマウスから調製したMEFにおいてもFRETは起こらなかったため、SMARTが起こすFRET現象にはMLKLの発現が必要であることが示唆された。そこでこの原因を明らかにするために活性化RIPK3をRIPK3のリン酸化抗体により検出した。その結果MLKLをノックアウトしたMEFではRIPK3の発現レベルは野生型のMEFのものと変わらないものの、計画的ネクローシス誘導後のリン酸化レベルが著しく低下し、かつ遅延していることが明らかとなった。このことからMLKLの発現がRIPK3活性化の効率に影響していることが明らかとなった。
核タンパク質であるHMGB1はネクローシスにより細胞外に漏出し、周囲の細胞に炎症を惹起すると考えられている。HMGB1の計画的ネクローシス誘導後の動態を明らかにするためLCI-SシステムによってイメージングしたところHMGB1の細胞外への放出の速度がFRETの変化の速度とよく相関していることが明らかとなった。この結果からRIPK3活性によってHMGB1放出の様式が制御されていることが明らかとなった。
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[Presentation] FRETバイオセンサーによるネクロプトーシス実行の１細胞イメージング2018
Author(s)
村井 晋, 山口 良文, 白崎 義隆, 進藤 綾大, 中林 修, Hildebrand Joanne, 冨田 太一郎, 赤羽 悟美, Silke John, 三浦 正幸, 中野 裕康
Organizer
第91回日本生化学会大会
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