タンパク質‐DNAハイブリッド分子ナノ構造体導入による細胞リプログラミング

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K01388
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 三重 正和 東京工業大学, 生命理工学院, 准教授 (40334528)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: DNA－タンパク質ハイブリッド分子 / Rep

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、細胞のリプログラミングを目指し、転写因子タンパク質－DNAハイブリッド分子を構築し、複数種の転写因子タンパク質を提示したナノ構造体を細胞内に導入する新たなタンパク質導入法の開発を目的とする。
研究初年度は、タンパク質－DNAハイブリッド分子構築法の開発を行った。ここでは、DNAを自身に共有結合するRepタンパク質を、その構築に利用した。ウイルス由来のRepタンパク質は、ウイルスの複製過程において、一本鎖DNA中にある認識配列を切断し、自身のチロシン残基に切断したDNAを共有結合する。そこで、目的タンパク質とRepの融合タンパク質を構築すれば、簡便にタンパク質－DNAハイブリッド分子が構築出来るものと考えた。Rep遺伝子を全合成し、大腸菌内において発現させ、精製後、DNAとの結合能を評価した。その結果、大腸菌で発現させたRepタンパク質が、in vitroにおいてもDNAとの共有結合が可能であることが明らかとなった。そこで次に、レポータータンパク質となるルシフェラーゼ（NanoLuc)との融合タンパク質を作製し、RepのDNA結合能および融合したレポータータンパク質の機能を評価した。その結果、レポータータンパク質をRepタンパク質のN末端側、C末端側のどちらに融合した場合でも、Repタンパク質はDNA結合能を保持していること、また融合したレポータータンパク質もその活性を保持していることを明らかにした。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Repタンパク質の発現が良好であったため研究は順調に進行したが、Repタンパク質のキャラクタリゼーションに予定以上の時間を費やしたため、当初予定した細胞導入実験までには到達しなかった。

Strategy for Future Research Activity

今後は、レポータータンパク質－DNAハイブリッド分子の細胞内導入を試みる。それと並行して、転写因子タンパク質－DNAハイブリッド分子を構築し、細胞内導入能、分化誘導能を評価する。更には、レポータータンパク質－DNAハイブリッド分子と転写因子タンパク質－DNAハイブリッド分子を、DNAを介して結合させ細胞内導入を試みる。

Causes of Carryover

予定した細胞導入実験に到達しなかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

研究次年度に持ち越された細胞導入実験において使用する。