2016 Fiscal Year Research-status Report
iPS細胞技術と内因性シュワン細胞誘導DDS技術を融合したハイブリッド型人工神経
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16K01393
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
中村 博亮 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (60227931)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上村 卓也 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 病院講師 (10597321)
高松 聖仁 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 客員准教授 (30295688)
岡田 充弘 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (40309571)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 人工神経 / ドラッグデリバリーシステム / 成長因子 / 末梢神経 / 再生医療 / iPS細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、人工神経を足場として成長因子（SDF-1とFGF）の二重徐放ドラッグデリバリーシステム（DDS）を構築し、内因性の神経修復細胞の動員を促すことで神経再生を促進させる新しい治療方法を開発する。これまで我々はiPS細胞由来神経前駆細胞を付加した人工神経による末梢神経再生を行ってきた。一方、DDSの発展とともに外部からの細胞移植だけではなく、内因性の細胞本来の自然治癒力を高めて組織再生を行うアプローチが再注目されている。しかし末梢神経の再生医療において、内因性に神経修復細胞（シュワン細胞や修復マクロファージ）の動員を促し神経再生を促進する試みは未だなされていない。内因性の本来の神経再生力を増幅した治療方法が確立されれば、我々がこれまでに開発した外的な細胞（iPS細胞由来神経前駆細胞）移植治療と組み合わせることで、内部外部の両者から神経再生促進を目指した理想的な再生医療となる。
まずSDF-1とFGFの両者を含有させたゼラチンハイドロゲルを人工神経に充填し、マウス体内における人工神経からの二重徐放効果を確認する（Dual-release人工神経の完成）。次にマウス坐骨神経損傷モデルに対してSDF-1/FGF Dual-release人工神経を用いて神経再生を行い、神経再生の促進効果とそのメカニズム（内因性シュワン細胞の動員）を解明する。最後に、これまで我々が報告してきた外的な細胞移植（iPS細胞由来神経前駆細胞）とこれら内因性神経修復細胞の動員を促すSDF-1/FGF Dual-release人工神経を組み合わせて、マウス坐骨神経損傷モデルに対して神経再生を行い、下肢機能回復や再生軸索数に関して従来法の自家神経移植と比較検討を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
SDF-1とFGFの2種類の成長因子をゼラチンハイドロゲルに吸着させることが可能であった。また、この成長因子を付加したゼラチンハイドロゲルは、人工神経に充填することが可能であり、人工神経を足場としてSDF-1とFGFの二重徐放（Dual-release）ドラッグデリバリーシステムを構築した。
次に、6週齢のマウス（C57BL6）の左坐骨神経に長さ5mmの神経欠損を作製し、広範囲坐骨神経損傷モデルを作製した。以下の群－1)人工神経単独、2)SDF-1付加人工神経、3)FGF付加人工神経、4)SDF-1/FGF二重付加人工神経、5)自家神経移植で移植再建を行った。人工神経1本当たりSDF-1は500ng、FGFは10μgとした。現在、移植後の評価を進めているところである。評価については、術後12週でマウスの下肢運動機能回復（フットプリントおよび温熱感作試験）について比較検討し、また筋電計を用いて再生神経の神経伝導速度を測定する予定である。神経再生について組織学的に評価するために、術後12週で人工神経もしくは移植自家神経を採取し、中央部横断切片を用いて抗neurofilament protein抗体による免疫染色を行い、画像解析ソフト（WinRoof）を用いて再生軸索数をカウントする予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
SDF-1/FGF 二重徐放による神経再生促進メカニズムについて組織学的に検討を行う。人工神経の長軸・短軸切片を用いて、SDF-1によって動員される内因性シュワン細胞を抗S-100抗体と抗P0抗体を用いて、また修復マクロファージの動員については抗CD206抗体を用いて同定を行う。またFGFによってこれらの修復細胞が増殖しているのか、抗Ki67抗体を用いた免疫染色で評価する。SDF-1の付加によって近位もしくは遠位の神経断端周辺に内因性のシュワン細胞や修復マクロファージが多く遊走してきているのか、またFGFの付加によってこれら神経修復細胞が増殖しているのか検証を行い、SDF-1/FGF Dual-release人工神経ではこれらの相乗効果が認められるのか検討する。
iPS細胞由来神経前駆細胞が生着した人工神経に、ゼラチンハイドロゲルを用いて成長因子（SDF-1とFGF）の二重付加を行う。6週齢のマウス（C57BL6）の左坐骨神経に長さ5mmの神経欠損を作製し、以下の群－1)人工神経単独、2)iPS細胞移植を併用した人工神経、3)SDF-1/FGF Dual-release人工神経、4)iPS細胞移植を併用したSDF-1/FGF Dual release人工神経、5)自家神経移植で移植再建を行う。術後12週でマウスの下肢運動機能回復について比較検討する。また筋電計を用いて再生神経の神経伝導速度を測定する。神経再生について組織学的に評価するために、術後12週で人工神経もしくは移植自家神経を採取し、中央部横断切片を用いて抗neurofilament protein抗体による免疫染色を行い、再生軸索数をカウントする。これによりiPS細胞移植を併用したSDF-1/FGF Dual release人工神経が、自家神経移植の神経再生を凌駕できるか検証できる。
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| Causes of Carryover |
本年度は実験消耗品など計画通りに助成金を使用していたが、購入物品の価格の関係上、わずかな額（175円）が次年度使用額として残存した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
前述の計画の通りに細胞培養費の一部として次年度に使用する予定である。
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