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2016 Fiscal Year Research-status Report

アポトーシス細胞の抗炎症メカニズムに着目した新たな炎症治療用材料の開発

Research Project

Project/Area Number 16K01402
Research InstitutionNational Institute for Materials Science

Principal Investigator

荏原 充宏  国立研究開発法人物質・材料研究機構, 国際ナノアーキテクトニクス研究拠点, MANA准主任研究者 (10452393)

Project Period (FY) 2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords炎症 / アポトーシス / スマートポリマー
Outline of Annual Research Achievements

炎症は、古くから熱・痛みを伴う赤みや腫れと広く理解され、感染や組織傷害に対して生体が発動する組織修復機構とされてきた。しかし、近年、この炎症が消散せず慢性化した状態が、数々の疾患の要因となっていることが示唆されている。最近の研究においても、アルツハイマー病の初期あるいは病気の確定後に、炎症に関与する抗体を投与することで症状が緩和し、認知課題において記憶が改善することが報告されている。しかし、抗体医薬は非常に高価であり、低分子薬の数倍から数十倍もする薬価がその普及を妨げている。そこで本提案課題では、アポトーシスを起こした細胞が細胞膜表面に露出するフォスファチジルセリン(PS)を介して免疫反応を抑制することに注目し、PSと類似構造を有するアポトーシス模倣新規合成ポリマーの合成およびその炎症治療への応用、特にアルツハイマー病への応用を目指す。抗アルツハイマー性評価は、脳免疫細胞にアミロイドb刺激を加え、細胞間伝達物質の産生量から抗アルツハイマー性を評価する。細胞間伝達物質はベータ型変異増殖因子と腫瘍壊死因子の産生量を測定する。また、神経細胞へ与える毒性をMTTアッセイによって評価する。以上の実験を踏まえ、低毒性かつアルツハイマー治癒能の高いPSポリマーの最適形態を探索する。特に平成28年度は、PSの活性部位を側鎖に有する新規PS誘導体モノマーの分子設計を行い、合成する。合成方法としては、DNAの固相合成に用いられるホスホロアミダイト試薬を転用する手法を試みる。合成したBOC保護PSモノマーをラジカル重合によって重合した後に、BOC基の脱保護反応を行う。反応溶液を濃縮後、透析操作、さらに凍結乾燥することでPSポリマーを得る。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成28年度は、PSの活性部位を側鎖に有する新規PS誘導体モノマーの分子設計を行った。合成方法としては、DNAの固相合成に用いられるホスホロアミダイト試薬を転用する手法を試みた。本反応を第一選択肢として採用する理由として、本反応能の中核を担うホスホロアミダイト試薬の高い反応制御性があげられる。本試薬は、中心のリン原子が3つの保護基によって保護されており、脱保護後にアミダイト試薬のリン原子が水酸基と結合し、亜リン酸エステルを形成することが知られている。すなわち、水酸基を有するモノマーを出発物質とすることで、モノマー由来の水酸基とセリン誘導体由来の水酸基の間にリン酸エステルを形成することが可能であると考えた。具体的には、BOC保護のセリンとホスホロアミダイト試薬を混和し、imidazole hydrochloride存在下で、2-hydroxyethyl methacrylate(HEMA)を加えることでBOC保護PSモノマーを得た。分離精製には、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いた。合成したBOC保護PSモノマーをラジカル重合によって重合する。重合したBOC保護PSポリマーにtert-butyl hydroperoxide、trifluoro aceticacidを加えることでBOC基の脱保護反応を行った。反応溶液を濃縮後、透析操作い、さらに凍結乾燥することでPSポリマーを得た。得られたPSポリマーの構造解析を1H NMRおよびGPCを用いて行ったところ、目的のポリマーの合成が確認された。平成29年度はこのポリマーを用いて抗炎症評価を行う。

Strategy for Future Research Activity

マウス由来マクロファージであるRAW264.7を用い、免疫反応において中心的役割を果たす転写因子である核内因子-kB (NF-kB) の活性を測定することで、PS含有ポリマーの抗炎症活性を評価する。マクロファージとPSポリマーを24時間共培養した後、炎症性刺激としてlipopolysaccharide (LPS) を加え、24時間後にNF-kB活性を測定する。同様に、炎症性サイトカイン(TNF-b,IL-6, IL-1b etc.)および抗炎症性サイトカイン(IL-10,TGF-b etc.)のレベルをEnzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)および電気泳動により測定する。コントロールとして、アポトーシス細胞においても同様の評価を行う。PSポリマーが、目的細胞表面のPSレセプターを介したシグナルによって、炎症に関わる転写因子を制御しているかについてウエスタンブロッティングにより確認する。具体的には、炎症性サイトカインの転写因子であるNF-kBの活性化に関与するIkBのリン酸化について検討を行う。また、本提案プロジェクトのゴールは、PSポリマーによる抗アルツハイマー性評価であるが、その実験を見据えて、脳免疫細胞MG-6(ミクログリア状細胞)にアミロイドb刺激を加え、細胞間伝達物質の産生量から抗アルツハイマー性を評価する。細胞間伝達物質はベータ型変異増殖因子(TGF-bアルツハイマー抑制)と腫瘍壊死因子a(TNF-a:アルツハイマー促進)の産生量を測定する。また、神経細胞(PC-12)へ与える毒性をMTTアッセイによって評価する。以上の実験を踏まえ、低毒性かつアルツハイマー治癒能の高いPSポリマーの最適形態を探索する。

  • Research Products

    (14 results)

All 2017 2016 Other

All Journal Article (5 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 5 results,  Open Access: 1 results) Presentation (4 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 4 results) Book (4 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Combinational Effects of Polymer Viscoeasticity and Immobilized Peptides on Cell Adhesion to Cell-selective Scaffolds2016

    • Author(s)
      Rio Kurimoto, Kei Kanie, Koichiro Uto, Shun Kawai, Mitsuo Hara, Shunsaku Nagano, Yuji Narita, Hiroyuki Honda, Masanobu Naito, Mitsuhiro Ebara, Ryuji Kato
    • Journal Title

      Analytical Science

      Volume: 32 Pages: 1195-1202

    • DOI

      10.2116/analsci.32.1195

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Fabrication of Temperature-responsive Hydrogels with Arbitrary Geometries by Using Self-healing Template2016

    • Author(s)
      Takeshi Sato, Mitsuhiro Ebara
    • Journal Title

      Chemistry Letters

      Volume: 45 Pages: 1394-1396

    • DOI

      10.1246/cl.160796

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Fluidity of biodegradable substrate regulates carcinoma cell2016

    • Author(s)
      Sharmy S. Mano, Koichiro Uto, Takao Aoyagia and Mitsuhiro Ebara
    • Journal Title

      AIMS Materials Science

      Volume: 3 Pages: 66-81

    • DOI

      10.3934/matersci.2016.1.66

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Design of Hemagglutinable Viral-Mimetic Surfaces with A Monolayer of Inactivated Sendai Virus (HVJ-E)2016

    • Author(s)
      Takaharu Okada, Koichiro Uto, Takao Aoyagi and Mitsuhiro Ebara
    • Journal Title

      Biomaterials Science

      Volume: 4 Pages: 96-103

    • DOI

      10.1039/C5BM00375J

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Reorganization of Cardiomyocyte Anisotropy in Response to Dynamic Nanotopographic Cues2016

    • Author(s)
      Paulos Y. Mengsteab1, Koichiro Uto, Alec S.T. Smith, Sam Frankel, Elliot Fisher, Zeid Nawas, Mitsuhiro Ebara, and Deok-Ho Kim
    • Journal Title

      Biomaterials

      Volume: 86 Pages: 1-10

    • DOI

      http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2016.01.062

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Presentation] Smart Nanofibers Technology Holds Promise for Future Medicine2016

    • Author(s)
      Mitsuhiro Ebara
    • Organizer
      The 11th SPSJ International Polymer Conference (IPC2016)
    • Place of Presentation
      Fukuoka
    • Year and Date
      2016-12-16
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 貼る癌治療用ナノファイバーメッシュの開発2016

    • Author(s)
      荏原充宏
    • Organizer
      第29回日本内視鏡外科学会総会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜
    • Year and Date
      2016-12-10
    • Invited
  • [Presentation] 形状記憶を有する生分解性ポリマー2016

    • Author(s)
      荏原充宏
    • Organizer
      第33回医用高分子研究会講座
    • Place of Presentation
      東工大大岡山キャンパス
    • Year and Date
      2016-11-17
    • Invited
  • [Presentation] スマートポリマー(スマポ)で拓く未来医療2016

    • Author(s)
      荏原充宏
    • Organizer
      第1回 レクチン利用技術研究会・ワーショップ
    • Place of Presentation
      産総研臨海副都心センター
    • Year and Date
      2016-09-12
    • Invited
  • [Book] 化学工学会誌2017

    • Author(s)
      新山瑛理, 荏原充宏
    • Total Pages
      3
    • Publisher
      抗癌活性を有するナノファイバーメッシュの開発
  • [Book] Synthetic Stimuli-responsive 'Smart' Fibers2016

    • Author(s)
      Simon Bou, Amanda V. Ellis, Mitsuhiro Ebara
    • Total Pages
      7
    • Publisher
      Current Opinion in Biotechnology
  • [Book] 医療に革命をもたらすスマートポリマーの開発2016

    • Author(s)
      荏原充宏
    • Total Pages
      4
    • Publisher
      化学経済
  • [Book] ナノファイバーシートによるガン治療2016

    • Author(s)
      新山瑛理, 宇都甲一郎, 荏原充宏
    • Total Pages
      8
    • Publisher
      シーエムシー出版
  • [Remarks]

    • URL

      http://www.nims.go.jp/bmc/group/smartbiomaterials/

URL: 

Published: 2018-01-16  

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