2016 Fiscal Year Research-status Report
アポトーシス細胞の抗炎症メカニズムに着目した新たな炎症治療用材料の開発
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16K01402
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| Research Institution | National Institute for Materials Science |
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Principal Investigator |
荏原 充宏 国立研究開発法人物質・材料研究機構, 国際ナノアーキテクトニクス研究拠点, MANA准主任研究者 (10452393)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 炎症 / アポトーシス / スマートポリマー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
炎症は、古くから熱・痛みを伴う赤みや腫れと広く理解され、感染や組織傷害に対して生体が発動する組織修復機構とされてきた。しかし、近年、この炎症が消散せず慢性化した状態が、数々の疾患の要因となっていることが示唆されている。最近の研究においても、アルツハイマー病の初期あるいは病気の確定後に、炎症に関与する抗体を投与することで症状が緩和し、認知課題において記憶が改善することが報告されている。しかし、抗体医薬は非常に高価であり、低分子薬の数倍から数十倍もする薬価がその普及を妨げている。そこで本提案課題では、アポトーシスを起こした細胞が細胞膜表面に露出するフォスファチジルセリン(PS)を介して免疫反応を抑制することに注目し、PSと類似構造を有するアポトーシス模倣新規合成ポリマーの合成およびその炎症治療への応用、特にアルツハイマー病への応用を目指す。抗アルツハイマー性評価は、脳免疫細胞にアミロイドｂ刺激を加え、細胞間伝達物質の産生量から抗アルツハイマー性を評価する。細胞間伝達物質はベータ型変異増殖因子と腫瘍壊死因子の産生量を測定する。また、神経細胞へ与える毒性をMTTアッセイによって評価する。以上の実験を踏まえ、低毒性かつアルツハイマー治癒能の高いPSポリマーの最適形態を探索する。特に平成２８年度は、PSの活性部位を側鎖に有する新規PS誘導体モノマーの分子設計を行い、合成する。合成方法としては、DNAの固相合成に用いられるホスホロアミダイト試薬を転用する手法を試みる。合成したBOC保護PSモノマーをラジカル重合によって重合した後に、BOC基の脱保護反応を行う。反応溶液を濃縮後、透析操作、さらに凍結乾燥することでPSポリマーを得る。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２８年度は、PSの活性部位を側鎖に有する新規PS誘導体モノマーの分子設計を行った。合成方法としては、DNAの固相合成に用いられるホスホロアミダイト試薬を転用する手法を試みた。本反応を第一選択肢として採用する理由として、本反応能の中核を担うホスホロアミダイト試薬の高い反応制御性があげられる。本試薬は、中心のリン原子が３つの保護基によって保護されており、脱保護後にアミダイト試薬のリン原子が水酸基と結合し、亜リン酸エステルを形成することが知られている。すなわち、水酸基を有するモノマーを出発物質とすることで、モノマー由来の水酸基とセリン誘導体由来の水酸基の間にリン酸エステルを形成することが可能であると考えた。具体的には、BOC保護のセリンとホスホロアミダイト試薬を混和し、imidazole hydrochloride存在下で、2-hydroxyethyl methacrylate(HEMA)を加えることでBOC保護PSモノマーを得た。分離精製には、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いた。合成したBOC保護PSモノマーをラジカル重合によって重合する。重合したBOC保護PSポリマーにtert-butyl hydroperoxide、trifluoro aceticacidを加えることでBOC基の脱保護反応を行った。反応溶液を濃縮後、透析操作い、さらに凍結乾燥することでPSポリマーを得た。得られたPSポリマーの構造解析を1H NMRおよびGPCを用いて行ったところ、目的のポリマーの合成が確認された。平成２９年度はこのポリマーを用いて抗炎症評価を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
マウス由来マクロファージであるRAW264.7を用い、免疫反応において中心的役割を果たす転写因子である核内因子-ｋB (NF-ｋB) の活性を測定することで、PS含有ポリマーの抗炎症活性を評価する。マクロファージとPSポリマーを24時間共培養した後、炎症性刺激としてlipopolysaccharide (LPS) を加え、24時間後にNF-ｋB活性を測定する。同様に、炎症性サイトカイン(TNF-b,IL-6, IL-1b etc.)および抗炎症性サイトカイン(IL-10,TGF-b etc.)のレベルをEnzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)および電気泳動により測定する。コントロールとして、アポトーシス細胞においても同様の評価を行う。PSポリマーが、目的細胞表面のPSレセプターを介したシグナルによって、炎症に関わる転写因子を制御しているかについてウエスタンブロッティングにより確認する。具体的には、炎症性サイトカインの転写因子であるNF-ｋBの活性化に関与するIｋBのリン酸化について検討を行う。また、本提案プロジェクトのゴールは、PSポリマーによる抗アルツハイマー性評価であるが、その実験を見据えて、脳免疫細胞MG-6(ミクログリア状細胞)にアミロイドb刺激を加え、細胞間伝達物質の産生量から抗アルツハイマー性を評価する。細胞間伝達物質はベータ型変異増殖因子(TGF-bアルツハイマー抑制)と腫瘍壊死因子a(TNF-a:アルツハイマー促進)の産生量を測定する。また、神経細胞(PC-12)へ与える毒性をMTTアッセイによって評価する。以上の実験を踏まえ、低毒性かつアルツハイマー治癒能の高いPSポリマーの最適形態を探索する。
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Research Products
(14 results)
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[Journal Article] Combinational Effects of Polymer Viscoeasticity and Immobilized Peptides on Cell Adhesion to Cell-selective Scaffolds2016
Author(s)
Rio Kurimoto, Kei Kanie, Koichiro Uto, Shun Kawai, Mitsuo Hara, Shunsaku Nagano, Yuji Narita, Hiroyuki Honda, Masanobu Naito, Mitsuhiro Ebara, Ryuji Kato
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Journal Title
Analytical Science
Volume: 32
Pages: 1195-1202
DOI
Peer Reviewed
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