2016 Fiscal Year Research-status Report
GADD34によるシグナル伝達系抑制と老化関連疾患の制御の解析
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16K01827
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
西尾 尚美 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 研究員 (80513457)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | Insulin/IGF1レセプターシグナル伝達系 / GADD34 / 老化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は，GADD34がインスリンレセプターからのシグナル伝達系を制御している可能性を検索するために，若齢マウス(2，5ヶ月齢)と老化マウス(6，10，12ヶ月齢)の肝臓細胞をin vitroで培養し，インスリンやグルコースで刺激をした後，Insulin/IGF1レセプターのシグナル伝達系の解析を行った。
これまでの研究では，GADD34遺伝子欠損(KO)マウスでは5カ月齢より若い時は，Insulin/IGF1レセプターのシグナル伝達系のAkt２のリン酸化が亢進しており，６カ月齢を過ぎた老化マウスでは低下していることが明らかとなっていた。そこで本研究では，Akt2よりさらに上流を検索した結果，InsulinとIGF1の共通部位であるTyr1162/1163のリン酸化が若いマウスで亢進しており，６カ月齢を過ぎた老化マウスでは低下していることが明らかとなった。従って，GADD34はInsulin/IGF1レセプターに直接関与することによって，Insulin/IGF1レセプターシグナル伝達系を制御していることが明らかとなった。
さらに，肝細胞を免疫染色してGADD34の発現部位を検討したところ，インスリン刺激後は細胞膜に強く発現し，その局在を確認したところ，細胞膜に発現するcaveolinやInsulin/IGF1レセプターと GADD34の発現部位は同じようなところに発現している可能性が示唆された。
そこで，さらに詳細な局在や他のタンパク質とのcomplexを確認するために，HEK293細胞に， FlagやMycのタグ付きGADD34ベクターを導入し，GADD34を強発現させて，Insulin/IGF1レセプターのリン酸化が抑制されていることをWesternで確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
肝細胞を用いた研究については，概ね，計画通りに遂行され，WTマウスとGADD34KOマウスの加齢によるシグナル伝達系の変化やGADD34KOマウスで脂質合成系の促進については明らかにすることができた。
しかし，免疫沈降によるGADD34の機能部位の解析では，研究が大幅に遅れている。HEK293細胞に， FlagやMycのタグ付きGADD34ベクターを導入し，GADD34を強発現させて，Insulin/IGF1レセプターのリン酸化が抑制されていることをWesternで確認した。ここまでは予定通りに進んでいたが，本研究の要であるInsulin/IGF1レセプターシグナル伝達系のレセプターのTyr1162/1163のリン酸化抗体が2016年9月に発注した後，2013年3月31日まで搬入されなかった。従って，ベクターによってGADD34を強発現させた細胞とこれまでの研究結果について再現性を確認する実験を行うことができずに，そこで実験が止まってしまっている。抗体の搬入を待っている間に，MEFや肝臓細胞を使って免疫沈降を試みたが，GADD34の発現が弱くて失敗をした。従って，GADD34強発現HEK293細胞が確かなものだという確認が取れるまでは，この細胞を使った免疫沈降とは行えなかったため，研究計画が全体的に遅れてしまっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度の4月にはInsulin/IGF1レセプターのTyr1162/1163のリン酸化抗体が搬入されるということなので，本年度に作成してストックしてある，インスリン刺激やグルコース刺激をしたGADD34強発現HEK293細胞のサンプルを用いて，Insulin/IGF1レセプターのシグナル伝達系をWesternで解析する。また，免疫染色を用いて，GADD34(Flag or Myc)，Insulin/IGF1レセプターのリン酸化，Caveolinなどのタンパク質の発現部位を確認すると同時に，これらのタンパク質とGADD34タンパクの結合を確認するために，FlagやMycを使って免疫沈降を行い，結合してくるタンパク質を検索する。
GADD34がインスリンシグナル伝達系のどの部位に関与するかを明らかにした後、老化に伴うインスリンシグナル伝達系の逆転メカニズムを詳細に研究する。検討内容は、①GADD34KOマウスでの炎症性サイトカイン（TNF-α）の産生亢進の可能性の検討，②GADD34KOマウスでの脂肪酸合成の亢進に関する検討，③GADD34KOマウスの細胞老化に関する検討，を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度に行う予定だった、GADD34強発現HEK293細胞の解析は、業者に委託した抗体作成が６ヶ月以上かかり、年度内に搬入されなかったため、研究が停滞してしまった。従って、GADD34強発現HEK293細胞の解析に必要だった経費も使われずに残ってしまった。
本実験は、抗体が搬入予定の次年度に繰り越しになり、同時に、解析に必要な費用も繰り越しとなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
2017年4月にInsulin/IGF1レセプターのTyr1162/1163のリン酸化抗体が搬入されることになったため、この抗体の費用と、それに付随する実験の解析費用として使用する。
また、本年度に失敗した免疫沈降による結合タンパクの同定実験において、新たな検索方法を模索した結果、この研究計画に必要である試薬、抗体、免疫沈降のためのキットを新たに購入するための経費として使用する。
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