Development of Chemical CALI method and application for modulation of cellular protein

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K01912
• Research Institution: University of Toyama
• Principal Investigator: 石本 哲也 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 助教 (40397170)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: ルシフェラーゼ / 活性酸素 / 細胞骨格

Outline of Annual Research Achievements

ChemicalCALIの基礎的研究を引き続き行った。緑の励起光に反応して活性酸素を放出する蛍光蛋白質KillerRed、ホタルの発光蛋白質であるルシフェラーゼの融合蛋白質をkillerfireflyと名付けたが、その蛋白質に重合アクチン結合ペプチドを融合させて（Lifeact-Killerfirefly)細胞に発現させ、ルシフェリン投与することによってアクチンフィラメントに特異的に活性酸素を作用させることによって、アクチンの重合を誘導することができることを示してきた。
この技術を用いて、細胞内のアクチンフィラメントに特異的に活性酸素を吹きかける処理を行うことにより、アクチンコフィリンロッドと考えられる構造が形成されることを昨年見出したが、今年度は、この構造がLifeact-Killerfirefly以外の方法で誘導した重合アクチンと形状が異なることを確認した。
また、Lifeact-Killerfireflyから本当に活性酸素が放出されているか、発せられる光のスペクトル解析を行ったところ、長波長側の光成分が増大していたことから、ホタルルシフェラーゼからKillerRedへのエネルギーの転移が起きていることがわかった。このことは、Lifeact-Killerfireflyから活性酸素が放出されていることを強く示唆し、ChemicalCALIの原理が正しいことを示す。
一方神経細胞にLifeact-Killerfireflyを発現させ、ルシフェリンを作用させることによって、スパインや樹状突起といったアクチンによって形状が規定される構造が変化するか調べたが、Lifeact-Killerfirefly発現によって神経細胞が細胞死を起こす傾向があり、結果を判断するまでに至らなかった。遺伝子導入法の改良など条件検討が必要になると考えられる。