人工デザイン膜タンパク質を用いた受容体の細胞外領域認識抗体作製法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K01915
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 竹田 浩之 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (40609393)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 抗体 / GPCR / 膜タンパク質 / ヒスタミン受容体 / 抗体医薬 / 細胞外ループ

Outline of Annual Research Achievements

GPCRの細胞外側領域に結合する抗体を効率的に取得するための人工デザイン抗原の作製を行った。ヒスタミン受容体HRH1を基にした人工デザイン抗原を２種類作製した。
一つはヒトのHRH1細胞外側領域と、マウスのHRH1細胞内領域の配列をもつキメラ抗原である。内側領域を免疫動物であるマウスの配列にする事で免疫寛容によって内側配列に対する抗体が誘導される事を抑制し、結果的に外側認識抗体の生産が促される事を期待する抗原である。キメラ抗原の立体構造が正しく折りたたまれているかどうか、培養細胞を用いたSheddingアッセイで確認した。キメラHRH1を発現させたHek細胞にヒスタミンで刺激を加えるとGタンパク質の応答がみられた事から、キメラ抗原は機能的であることが確認された。
もう１つはヒトの細胞外領域（ループと膜貫通領域の外側）がタンデムに繋がった細胞外領域抗原である。こちらはGPCRとしての構造・機能は損なわれるが、細胞外ループを抗原として効果的に提示できると期待される。
作製したコンストラクトを用いて、コムギ無細胞系を用いて抗原タンパク質の大量調製を行った。野性型HRH1, キメラHRH1, 細胞外ループHRH1の３種とも、コムギ胚芽抽出液１mLあたり1mg以上の高い生産効率で合成できる事を確認した。無細胞合成をスケールアップし、それぞれの抗原を数mg調製し、免疫に用いた。
無細胞合成した野性型及び人工デザインHRH1抗原をマウス10匹ずつに免疫し、抗血清を得た。現在、抗血清の解析を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画で予定していた人工デザイン抗原の構築、無細胞系を用いた合成テストを完了した。数mgの免疫抗原を大量生産し、マウスへの免疫を実施した。計画していたスケジュール通り実験を遂行できている事から、概ね順調に進展していると言える。

Strategy for Future Research Activity

次年度は、免疫したマウス抗血清の解析を進め、外側認識抗体の誘導の有無をFACS、Western blotting, AlphaScreenなどを用いて確認する。
細胞外領域に結合する抗体が確認できた場合、抗体の機能解析を実施する。また、再度免疫を行い、モノクロ抗体の取得を検討する。
細胞外領域に結合する抗体が誘導されていなかった場合、抗原デザインの変更、または免疫動物の変更などを検討する。