2017 Fiscal Year Research-status Report
人工デザイン膜タンパク質を用いた受容体の細胞外領域認識抗体作製法の開発
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16K01915
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
竹田 浩之 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (40609393)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 抗体 / GPCR / 膜タンパク質 / ヒスタミン受容体 / 抗体医薬 / 細胞外ループ / 人工タンパク質デザイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度、無細胞合成ヒスタミン受容体H1 (HRH1)の野性型及び人工デザイン抗原2種を免疫したマウス血清をWestern blotting、フローサイトメトリーなどを用いて解析した。野性型抗原とキメラ抗原を免疫した個体ではHRH1に対する抗体が検出された。しかし抗原HRH1 のN末端を切除すると結合しなくなったことから、誘導されたのはHRH1のN末端に結合している抗体であり、ループやポケット領域に結合する抗体は誘導されていなかった。一方で、細胞外領域抗原を免疫した個体ではHRH1に対する抗体は誘導されなかった。人工膜タンパク質の局所構造が大きく崩れ、抗原として機能しなかったものと考えられた。
以上の結果を受け、新たな抗原デザインに着手した。HRH1の立体構造モデルと脂質二重膜の厚さを考慮した結果、HRH1のループ領域は非常に短く、ほぼ脂質膜に埋まっていることに着目した。膜貫通ヘリックスを人工的に延長し、ループ部分が膜から露出しやすくするデザインを検討した。基本コンセプトとして、ループ部分と膜貫通ヘリックスの間にスペーサーとなるアミノ酸を１から５残基挿入した。デザインした人工膜タンパク質を無細胞合成し、ラジオリガンドアッセイによりリガンド結合能を評価した。１残基及び３残基のスペーサーを挿入した人工デザインHRH１は野性型と同等以上の結合能を示した。一方で、５残基のスペーサーを挿入したHRH1は結合活性が著しく低下した。RI標識していないリガンドとの競合実験で、人工デザインHRH1とラジオリガンドの結合が特異的であることを確認した。
ラジオリガンドアッセイの結果から、結合能を有する人工デザインHRH1を２種選定し、免疫に供するため、無細胞合成により1 mgの抗原を調製した。これらの抗原による細胞外ループ抗体誘導を評価するため、マウスへの免疫を準備している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
フローサイトメトリーなどを用いたマウス抗血清の評価を完了したこと、新たなコンセプトに基づく細胞外ループ伸長HRH1抗原デザインを考案し、ラジオリガンドアッセイを用いて人工HRH1抗原の活性評価を行ったことなどから、概ね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度は、新たにデザインした人工HRH1抗原をマウスに免疫し、細胞外ループ結合抗体の誘導をフローサイトメトリーなどを用いて評価、確認する。細胞外領域に結合する抗体の誘導が確認された場合、シェディングアッセイなどを用いて抗体の機能解析を実施する。
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