2016 Fiscal Year Research-status Report
動物細胞の時計リズムのＮＯ、ＣＯシグナルによる制御機構の解析
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16K01917
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University |
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Principal Investigator |
佐上 郁子 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (10143033)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 時計リズム / ヘム / 一酸化炭素 / 一酸化窒素 / 遺伝子発現 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウス Per2, Bmal1 遺伝子のプロモーター/エンハンサー領域(それぞれNPAS2(CLOCK) /BMAL1の結合する E-box, Rev-erbの結合する RORE を含む)をルシフェラーゼ遺伝子上流に導入したリポーター遺伝子をNIH3T3細胞に導入し，安定に発現する細胞株を単離した。この細胞集団をデキサメサゾン処理することで時計リズムを同調し、同調後２４時間目に培地中に、 CO発生試薬 CORM2 [Ru(CO)3Cl2]2を投与することで、リズムに対するCOの効果をリアルタイムで観測した。その結果、CO投与後Per2レポーターの発現の振幅がCO濃度依存的に減少し、位相が一過性に前方にシフトした。また、Per2レポーターとは逆の位相を示すBmal1レポーターの発現の振幅は、CO投与によってやはり減少し、CO投与後の位相全体が前方シフトした。Hemin投与によっても、CO投与と同様の傾向を示したが、ヘム合成系阻害剤のサクシニルアセトンの投与は、Per2, Bmal1レポーターどちらの発現リズムにも顕著な効果は見られなかった。これらの結果は、時計リズムのコア制御因子であるPer2, Bmal1 遺伝子の発現が、ヘムの分解、分解物であるCOによって制御されることを示している。
さらにNOの発生試薬であるNOC12を培地に投与することで、Per2, Bmal1レポーターの発現リズムに対するNOの効果も検討中であるが、今のところPer2の発現りズムにはほとんど影響しないが、一方Bmal1の発現の振幅を減少させるという結果を得ている。これらの結果は、それぞれの遺伝子発現に関与する転写因子の機能に対するNO効果の違いを反映していると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り、体内時計リズムを制御するコア因子であるPer2, Bmal1 遺伝子の発現リズムをリアルタイムで追跡することに成功し、そのリズムに対するCOやNOの効果を観測することができた。特に、ヘムの代謝によって生成するCOが、時計リズムの制御因子になることを示した。したがって、２８年度の当初の計画の多くを達成できた。一方で当初計画したHO-1 やNOSの発現リズムを定量的RT-PCRで解析することがまだ達成できていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）平成28年度の研究によって、CO発生試薬CORM2の投与によって、Per2レポーターの発現の位相が一過性に前方にシフトしたが、４８時間を過ぎると元に戻った。その原因の一つとしてCORM2投与後の培地中のCO濃度を追跡したところ、CORM2は一過性にしかCOを発生していない。そこで、もっと長時間COを発生する別の試薬CORM3を用いて、CO効果を解析する。
（２）CO/NO 効果が NPAS2 および REV-erbβ 介したものであることを ChIP アッセイで確かめる。 リズムの変調が +/- CO、NO で効果の大きい条件での動物細胞をもちいて、Per2 遺伝子のプロモー ターにある E-box 領域への NPAS2 の実際の結合を NPAS2 抗体を用いたクロマチン免疫沈降法 (ChIP)で、 また Bmal1, Npas2 遺伝子のプロモーターにある RORE への Rev-erbβ の実際の結合を その特異抗体を用いたChIPアッセイで、経時的に解析する。 これまでの我々のin vitro実験系 の結果では、CLOCK はへムを結合するが、CO の効果は見られなかった。そこで、 CLOCK の E-box結合 についても、同様に CLOCK抗体を用いて ChIP アッセイを行い、CO や NO の効果の有無をあきらかにする。
（３）HO-1 および NOS の過剰発現系導入の効果の解析
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| Causes of Carryover |
申請書では、初年度に細胞培養用 CO2インキュベーターを更新する予定であったが、交付額が減ったために購入できず、以前からある古いインキュベーターを使用している。その費用分を消耗品等に回した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の交付額は申請額より減額されているので、繰り越した分は、CHIPアッセイに必要な数種類の抗体やそれらに対応した磁気ビーズなどを購入費用に充てる。
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Research Products
(2 results)
