2017 Fiscal Year Research-status Report
前駆体蛋白質の分子進化における品質管理機構の解明と分子設計への応用
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16K01925
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
日高 雄二 近畿大学, 理工学部, 教授 (70212165)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | フォールディング / シャペロン / 分子進化 / ウログアニリン / 前駆体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成29年度は、分子内シャペロン機能を有する前駆体プロウログアニリンの分子進化における品質管理機構の存在について焦点を絞り、研究を行った。本目的のため、ヒトだけでなく、ウナギ（魚類）およびツメバケイ（鳥類）由来プロウログアニリンを遺伝子組換え体として作成し、その立体構造形成反応を行い、反応機構について調べた。研究はおおむね順調に進んでおり、研究過程において新たな知見を得ることができ、さらなる検討の必要性が生じている。
１）ウナギおよびツメバケイ由来プロウログアニリンの立体構造形成：各前駆体タンパク質を遺伝子組換え体として調製し、それらの立体構造形成を評価した。いずれも、直接、前駆体を組換え体として得ることはできなかったが、融合タンパク質として発現し、その後、酵素切断により入手することに成功した。それらの立体構造形成を調べたところ、当初の予想に反して、ウナギでは正しい立体構造形成が起こるにもかかわらず、鳥類では完全には正しい立体構造形成がおきづらいことが分かった。これらの結果と、短鎖ペプチドの立体構造形成および解析結果から、分子進化機構について仮説をたてつつある。特に、アルファヘリックス構造への進化の理由が説明されつつある。
２）de novoデザインした新規生理活性物質のデザインにおいては、部位特異的変異体を用いた立体構造形成実験から、分子内シャペロン機能の最終段階での重要な役割が明らかになりつつあり、想定以上の成果が得られた。結晶構造解析からヒト由来プロウログアニリンの成熟体領域とプロ領域をつなぐヒンジ部位に水素結合が見つかっている。現時点では、その水素結合が、立体構造形成の最終段階での選択性を制御しているものと予想している。そこで、この知見に基づき、さらなる新規生理活性ペプチドの創作に取り組みつつある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）ヒト型プロウログアニリンについてその変異体を用いた立体構造形成機構の解析および昨年度来続けてきたＮＭＲによるそれら中間体類似体の立体構造形成解析により、これまで予想していた立体構造形成途中での品質管理機構は、さらにもう一段階の管理機構の存在を明らかにすることができた。すなわち、分子内シャペロンによる立体構造形成は大きく2段階の品質管理機構で行われ、こまかくは3段階の品質管理が行われていることを意味している。現在、このさらなる品質管理機構の存在意義について精査しているところである。
２）魚類および鳥類における前駆体プロウログアニリンの立体構造形成の実験から、魚類では、ヒト型とは異なる中間体を経由している可能性が高まり、反応中間体を変更することで分子進化を遂げた可能性が高まった。本内容は、分子進化と立体構造形成反応の関連との観点から、本成果は画期的な内容を含んでおり、今後、精査したのち、高レベルでの論文投稿を予定している。
３）人工設計した混成前駆体タンパク質の立体構造形成反応を調べたところ、ある変異体では、ジスルフィド結合の架橋様式が同じであるにもかかわらず、立体構造が異なるトポロジカル異性体を選択的に形成することが分かった。この結果は、変異した部位が分子内シャペロン機能の最終段階の立体選択性に関与していることを意味しており、今後の検討が必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
1）平成29年度に、魚類から、両生類、爬虫類、哺乳類（ヒトなど）について、インフォマティックによる解析から、分子進化過程を予想した。そこで、それらのうち、代表的なものの遺伝子組換え体を調製し、立体構造形成を精査する。また、分子進化上かけ離れたヒトと魚類（メダカ）のヒンジ領域におけるハイブリッド体を形成し、その立体構造形成を調べることで、品質管理機構を精査する。特に、フォールディング中間体がヒトとウナギで異なるものと予想されているため、本前駆体の立体構造形成が分子進化上重要な知見を与えるものと考える。
２）混成タンパク質の立体構造形成と分子内シャペロンの最終制御機構の解明：最終段階での選択性に関与すると予想されるヒンジ領域のAsp残基との水素結合形成を制御するため、成熟体領域の電子ドナーを特定する。それら変異体の立体構造形成および成熟体領域のみの立体構造形成とを比較し、分子内シャペロンが分子進化の過程で現在まで生き残った理由について明らかにする。
3）平成28，29年度の研究過程において、様々な遺伝子組換え前駆体タンパク質の調製を行った。しかし、それらの中には大腸菌宿主では全く得られないものもいくつか見られた。そこで、遺伝子組換え法と化学合成法を用いた手法を開発し、本研究に適応することにしたところ、これまでまったく知られていない化学反応を発見するにいたった。本手法は、すでに論文作成し、現在投稿直前であるが、本手法をオレキシンなどの前駆体タンパク質に応用することで、様々な翻訳後修飾を持つタンパク質の調製が可能になった。そこで、平成30年度は、オレキシンを代表とした翻訳後修飾をもつタンパク質の調製を行い、それらの立体構造形成について調べる。
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| Causes of Carryover |
（理由）本年度は遺伝子組換えによる種々の変異前駆体タンパク質の調製とその立体構造形成機構を明らかにすることに焦点を絞り研究を行った。ほぼ、計画通りの進行状況であったため、当初の予定通り、順を踏んで研究発表を行うことにし、その予算を使用した。しかし、米国国際学会への参加予定であった研究協力者（院生）が、事情により、直前に参加できなくなったため、そのための旅費、宿泊費、参加費（合計約17万円）が残金として計上された。また、本研究費以外の研究支援金を別途入手できたため、本研究費が少し（14万円ほど）残ることになった。
（使用計画）ヒト、ウナギ（魚類）、ツメバケイ（鳥類）の化学合成ペプチドあるいは前駆体タンパク質を用いた立体構造形成の研究から、特にヒンジ領域の役割が明らかになりつつある。平成30年度は、これらの情報をより精査するため、それら変異体の遺伝子組換えによる調製および研究成果の発表に、繰越金を使用予定である。、
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Research Products
(20 results)
