2018 Fiscal Year Research-status Report
前駆体蛋白質の分子進化における品質管理機構の解明と分子設計への応用
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16K01925
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
日高 雄二 近畿大学, 理工学部, 教授 (70212165)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | フォールディング / シャペロン / 分子進化 / ウログアニリン / 前駆体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成30年度は、引き続き、分子内シャペロン機能を有する前駆体プロウログアニリンの分子進化における品質管理機構の存在について焦点を絞り、研究を行った。本目的のため、ヒトだけでなく、アリゲーター（爬虫類）、ウナギ（魚類）およびツメバケイ（鳥類）由来プロウログアニリンを遺伝子組換え体として作成し、その立体構造形成反応を行い、反応機構について調べた。研究はおおむね順調に進んでおり、研究過程において新たな知見を得ることができ、さらなる検討の必要性が生じている。
１）異種由来プロウログアニリンの立体構造形成：各種由来の前駆体タンパク質を遺伝子組換え体として調製し、それらの立体構造形成を評価した。昨年度の検討により、それぞれの種の前駆体を、直接、組換え体として得ることができるようになったため、それらの立体構造形成を調べた。その結果、鳥類以外のものでは正しい立体構造形成が起こることが分かった。これらの結果と、短鎖ペプチドの立体構造形成および解析結果から、分子進化機構について仮説をたてつつある。特に、立体構造形成の最終段階であるアルファヘリックス構造への構造転移を伴った進化の理由が説明されつつある。
２）de novoデザインした新規生理活性物質のデザインにおいては、部位特異的変異体を用いた立体構造形成実験から、分子内シャペロン機能の最終段階での重要な役割が明らかになりつつあり、想定以上の成果が得られた。そこで、成熟体領域とプロ領域をつなぐヒンジ部位の水素結合の重要性をしらべるため、水素結合を有さない種々の変異体を作成し、それらの立体構造形成反応を調べた。その結果、ヒンジ部位での水素結合が、予想通り、立体構造形成の最終段階での構造選択性を制御していることが明らかになった。また、現在、この知見に基づき、さらなる新規生理活性ペプチドの創作および立体構造形成反応を検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）ヒト型プロウログアニリンについてその変異体を用いた立体構造形成機構の解析および昨年度来続けてきたＮＭＲによるそれら中間体類似体の立体構造形成解析により、これまで予想していた立体構造形成途中での品質管理機構は、さらにもう一段階の管理機構の存在を明らかにすることができた。すなわち、分子内シャペロンによる立体構造形成は大きく2段階の品質管理機構で行われ、こまかくは3段階の品質管理が行われていることを意味している。また、その最終段階の立体構造の選択がプロセッシング部位における水素結合により制御されていることが分かってきた。本プロジェクトの核心部分がほぼ完結しつつあり、確証を得るための実験を残すのみとなったため、順調であると判断した。
２）魚類、鳥類および爬虫類における前駆体プロウログアニリンの立体構造形成の実験から、魚類では、ヒト型とは異なる中間体を経由している可能性が高まり、反応中間体を変更することで分子進化を遂げた可能性が高まった。そこで、本知見を基に、ヒトと魚類のカセット変異体を作成し、分子進化を加速させたものの立体構造形成を評価することができた。分子進化と立体構造形成反応の関連との観点から、本成果は画期的な内容を含んでおり、今後、精査したのち、高レベルでの論文投稿を予定しているため。
３）人工設計した混成前駆体タンパク質の立体構造形成反応を調べたところ、ジスルフィド結合の架橋様式が同じであるにもかかわらず、立体構造が異なるトポロジカル異性体を選択的に形成することが分かった。この結果から、ヒンジ領域の水素結合性が最終段階の立体構造の選択性に関与していることが分かったため、その立体構造解析を行うにいたった。現在、ＮＭＲ法による立体構造解析を進行中であり、今後、十分に目的を達成することができると判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
1）平成30年度に、魚類から、両生類、爬虫類、哺乳類（ヒトなど）について、インフォマティックによる解析から、分子進化過程を予想し、おおむね目的を達成することができた。しかし、前述のように、鳥類においては、唯一、天然型の形成効率が低いものであった。そこで、鳥類の他の遺伝子について発現実験を行い、本結果が鳥類独自のものであるのかを確認する。
２）分子進化を加速した前駆体タンパク質の立体構造解析：分子進化上かけ離れたヒトと魚類（メダカ）のヒンジ領域におけるハイブリッド体を形成し、その立体構造形成を調べたところ、正しい立体構造形成が行われることが分かった。そこで、本タンパク質の立体構造をＮＭＲ法で決定する。
３）混成タンパク質の立体構造形成と分子内シャペロンの最終制御機構の解明：最終段階での選択性に関与すると予想されるヒンジ領域のAsp残基との水素結合形成を制御するため、成熟体領域の電子ドナーを特定する。それら変異体の立体構造形成および成熟体領域のみの立体構造形成とを比較し、分子内シャペロンが分子進化の過程で現在まで生き残った理由について明らかにする。
４）既に作成した、新たなde novoデザイン蛋白質について、その前駆体での立体構造を解析し、成熟体領域が、前駆体中でどのように安定化されているのかを調べる。本研究成果は、本プロジェクトとの発展性を促すものであり、分子進化と生理活性構造形成の中核をなすものと位置づけられる。
以上、おおむね、予定通りに進んでおり、今後、本プロジェクトで得られた成果を発表することに尽力する。
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| Causes of Carryover |
本年度は遺伝子組換えによる種々の変異前駆体タンパク質の調製とその立体構造形成機構を明らかにすることに焦点を絞り研究を行った。ほぼ、計画通りの進行状況であったため、当初の予定通り、順を踏んで研究発表を行うことにし、その予算を使用した。しかし、本勤務校公務のため、予定していた米国国際学会への参加ができなくなったことにより、支出予定旅費（約20万円）が残金として計上された。また、本研究費以外の研究支援金を別途入手できたため、本研究費が少し（約20万円）残ることになった。
（使用計画）最終年度となるため、本研究成果を発表するための学会発表に伴う旅費等への支出を行う。また、本研究成果の抑えの実験として、ペプチドの化学合成あるいは前駆体タンパク質のNMRによる立体構造解析の費用に用いる。
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Research Products
(14 results)
